半胱氨酸酶在NS398诱导HepG2细胞凋亡中的作用

【摘要】 目的 探讨选择性环氧合酶(cox2)抑制剂ns398诱导肝癌hepg2细胞凋亡的分子机制。方法 采用流式细胞术测定细胞凋亡情况;western blot法检测不同浓度ns398处理后凋亡相关蛋白bcl2、caspase3表达的变化;并以流式细胞术检测半胱氨酸酶3(caspase3) 酶活性的变化。结果 流式细胞术显示ns398(0、100、200、300、400μmol/l)作用hepg2细胞24h后,对照处理组没有出现凋亡峰,其余各组(100、200、300、400μmol/l)出现明显的凋亡峰,其凋亡率分别为(10.51±1.04)%、(27.79±2.40)%、(45.72±3.32)%,(60.22±2.03)%(p<0.01),不同浓度ns398处理后凋亡相关蛋白bcl2表达下降,caspase3蛋白表达增加,随着ns398处理浓度的增加,表达活性caspase3的细胞百分率分别为(2.67±0.22)%、(9.53±0.15)%、(21.28±0.43)%、(39.63±0.8)%、(63.40±0.69)%(p<0.01)。结论 选择性cox2 抑制剂可能通过调节bcl2蛋白表达活化caspase3,从而诱导肝癌细胞hepg2凋亡。

【关键词】 环氧水合酶类; caspase3; bcl2; 凋亡;hepg2

significance of caspase in ns398 induced apoptosis of hepg2 cell line

hu dongxia

department of hematology and oncology, hospital affiliated to wuhan university of science and technology, wuhan 430064, chinaabstract：objective to investigate the possible role of bcl2 and caspase3 in ns398 induced apoptosis of liver tumor hepg2 cell line. methods cell apoptosis is determined by flowcytometry analysis using pi expression of bcl2 and caspase3 protein was detected by western blot. caspase3 activity was evaluated by active caspase3 apoptosis kit with flow s selective cox2 inhibitor ns398 can significantly induce apoptosis of hepg2 cells line significantly. flow cytometry assay revealed the apoptotic rate of hepg2 cells treated with different concentrations of ns398 (0,100,200,300,400μmol/l) was (10.51±1.04)%,(27.79±2.40)%,(45.72±3.32)%,(60.22±2.03)%(p<0.01) respectively,while the apoptotic peak did not appear in the control group (p<0.01).the expression of caspase3 protein was upregulated while bcl2 protein was downregulated,and the percentage of the cells with active caspase3 was (2.67±0.22)%, (9.53±0.15)%, (21.28±0.43)%, (39.63±0.8)%, (63.40±0.69)% (p<0.01). conclusion selective cox2 inhibitor ns398 may activate caspase3 by downregulating the expression of bcl2 protein,which causes apoptosis of hepg2 cells.

key words：cyclooxygenase2;apoptosis;caspase3; bcl2; hepg2
近年研究表明, 环氧化酶2(cox2)在多种恶性肿瘤中表达上调,能诱导肿瘤的发生、浸润和转移[1]。流行病学研究表明, 非甾体抗炎药(nsaids)可降低消化系统恶性肿瘤的发生率和死亡率[2],有研究报道,其抗癌机制和抑制cox2有关。cox2在慢性肝炎、肝硬化及肝细胞癌组织中的表达明显增高[34]。因而,选择性阻断或抑制cox2的活性,可能有利于肝细胞癌的预防和治疗。本实验观察ns398对体外培养肝癌细胞hepg2的作用,并探讨抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的可能机制,为ns398的抗癌作用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂 ns398 纯品、培养基rpmi 1640（美国sigma公司）, 鼠抗人bcl2、caspase3单克隆抗体(美国santa cruz 公司), rnase、1kb dna ladder、碘化丙啶(pi)和caspase3活性检测试剂盒（深圳晶美公司)。

1.2 细胞培养 人肝肿瘤细胞株hepg2购自上海科学院细胞中心。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及链霉素100u/ml的rpmi1640培养基中37℃、5% co2条件下培养箱中贴壁培养,每48h换液传代一次,取生长良好，细胞活性大于98%的细胞进行实验。

1.3 细胞周期测定 将终浓度为100、200、300、400μmol/l的ns398与肝癌细胞作用24h后, 0.25%胰酶消化,收集制成1×105个细胞的单细胞悬液, 收集六孔板内细胞制备单细胞悬液。磷酸盐缓冲液(pbs)洗2次,70%冰乙醇固定。检测时以pbs洗2次,加入200μl rnasea(1g/l),37℃水浴30min,再加pi染色液避光反应30min,上机检测,multicycle软件分析亚二倍体峰。

1.4 细胞蛋白质样品制备及蛋白定量 hepg2细胞bcl2和caspase3蛋白质表达:以1×106个hepg2细胞接种于100ml培养瓶,细胞贴壁后换液,加入不同浓度的ns398的使其终浓度分别为100、200、300、400μmol/l。设不进行药物干预的细胞为对照组。经处理后的细胞立即弃去培养液,洗涤,离心。加预冷的细胞裂解液(0.1mol/l nacl, 0.01mol/l tris hcl,ph 7.6, 0.001mol/l edta,100μg/ml pmsf,2μg/ml leupeptin)0.1ml,裂解30min, 然后与10 000g离心10min,取上清备用。以上所有操作均在4℃下进行。测定蛋白,并调各组蛋白浓度一致。

1.5 western blot分析bcl2和caspase3内参照βactin表达水平 按文献[5]报道的western blot方法检测,蛋白提取物经定量后，取25μg在sdspage凝胶上电泳。转膜到醋酸纤维素膜上，丽春红染色观察转膜情况。转膜成功后，用5%的脱脂奶粉封闭2h。加一抗cox2抗体，内参照βactin抗体）在4℃条件下过夜孵育；充分用pbs漂洗3次，每次10min，再用二抗（1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔、羊抗鼠igg）震荡孵育2h。洗去未结合的二抗，滴加ecl化学发光试剂，x线片曝光显影。扫描x线片，计算机软件处理，软件进行扫描定量,每个浓度组重复3次,取均值代表测定结果。

1.6 caspase3活性检测 采用active caspase3 apoptosis kit检测caspase3活化情况。不同浓度ns398(0、100、200、300、400μmol/l)处理的hepg2细胞六孔板内培养24h后,收集细胞制备单细胞悬液, 1.5ml pbs清洗后加破膜剂a 100μl,避光孵育15min后,以2ml pbs清洗, 1 800r/min离心5min,弃上清, 加入100μl b液+caspase3pe抗体或同型对照抗体,置4℃反应20min,再以2ml pbs清洗,离心弃上清,再以1ml pbs重悬,并上机分析。用标准荧光微球校准光路和流路,以fs和ss设门,用阴性对照确定阴性范围,依次上机检测,每个样本检测1×105细胞。

1.7 统计学方法 采用spss11.5统计软件包进行t检验分析。

2 结果

2.1 ns398对hepg2细胞周期和凋亡率的影响

fcm显示,不同浓度ns398作用24h后, 呈浓度依赖性改变细胞周期分布, 一方面增高g0/g1期细胞的比例,另一方面降低s期和g2/m期的细胞比例,见表1。表1 ns398对hepg2细胞周期的影响在dna图谱g0/g1期前出现一个代表凋亡细胞的亚g1峰, 对亚g1峰进行定量分析表明,4种不同浓度的ns398作用于hepg2细胞24小时后,均显示亚g1峰,ns398呈剂量依赖性非线性方式诱导其凋亡，见图1。

2.3 ns398对hepg2细胞bcl2、 caspase蛋白表达的影响

hepg2细胞经不同浓度ns398(0、100、200、300、400μmol/l)处理24h后,western blot显示随着ns398处理浓度的增加，bcl2蛋白表达下降，caspase3蛋白表达上调，见图2。

2.4 ns398 对hepg2细胞caspase3活性的影响

随着ns398浓度的增高,caspase3明显活化,并且以高浓度为明显。不同浓度(0、100、200、300、400μmmol/l)ns398处理hepg2细胞24h后,表达活化caspase3的细胞百分率分别为(2.67±0.22)%、(9.53±0.15)%、(21.28±0.43)%、(39.63±0.8)%、(63.40±0.69)%。呈明显的剂量依赖性(p<0.01)。

3 讨论

有研究报道[67]cox2的抑制剂对人类前列腺癌和胰腺癌细胞有抑制增殖和诱导凋亡的作用。本组实验结果显示, ns398处理后在dna图谱g0/g1期前出现一个代表凋亡细胞的亚g1峰,对亚g1峰进行定量分析了解细胞凋亡率,结果显示ns398其凋亡诱导作用随药物浓度升高而增强,这表明选择性cox2抑制剂ns398对肝癌hepg2细胞有凋亡诱导作用。然而选择性cox2抑制剂诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制目前仍不清楚。bcl2家族是最重要的凋亡调节因子之一, 它通过调节线粒体的功能来调节凋亡[8]。bcl2可稳定线粒体膜并通过蛋白相关转换孔维持膜的通透性,线粒体内膜很少有死亡启动因子,诸如细胞色素c(cytochrome c)和半胱氨酸酶(caspase)等。caspase是一组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶, 其家族成员中研究最多、功能相对较明确的为caspase3，它广泛分布于各种类型的细胞中, 在细胞内以无活性的前体(酶原)形式存在,被激活后在细胞凋亡中发挥关键作用,caspase3为凋亡的效应分子,是凋亡途径下游进行底物酶解的关键蛋白酶,被称为凋亡的“执行者”。本实验发现,不同浓度的ns398诱导hepg2 细胞凋亡的同时发现hepg2细胞caspase3蛋白表达增加,而bcl2 蛋白表达水平呈剂量依赖性下降。使处理后的hepg2细胞呈程序性死亡[910] 研究结果证实bcl2在线粒体膜上形成蛋白孔道使细胞线粒体跨膜电位下降,细胞线粒体下降后释放细胞色素c,激活caspase蛋白酶级联反应[11]。本实验结果显示ns398处理hepg2细胞后其caspase3酶活性升高,因此我们推测ns398可能通过调节bcl2蛋白的表达激活caspas3,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。

总之,我们的实验结果表明选择性cox2 抑制剂能够诱导肿瘤细胞凋亡,这种效应可能与caspase3蛋白表达增加,bcl2 蛋白表达下降,从而活化caspase3有关。确切的机制还有待于进一步深入研究。

【参考文献】
［1］ tsujii m,kawano s,tsuji s,et xygenase regulates angiogenesis induced by colon cancer cells[j]. cell,1998,93(5):705716.

[2] sandler rs, galanko jc, m urray sc, et al. aspirin and nonsteroidal antiinflammatory agents and risk for colorectal adenomas[j].gastroenterology, 1998,114（3）:441447.

[3] shiota g,okubo m,noumi t,et xygenase2 expression in hepato2 cellular carcinoma[j].hepatogastroenterology,1999,46（25）:407412.

[4] sheng h,shao j,morrow jd,et tion of apoptosis and bcl2 expression by prostaglandin e2 in human colon cancer cells[j]. cancer res, 1998,58（2）:362366.

[5] towbin h,staehlin t,gordon ophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:procedure and some applications[j].proc natl acad sci usa,1979,76（9）:43504354.

[6] kamijo t,sato t,nagatomi y,et ion of apoptosis by cyclooxygenase2 inhibitors in prostate cancer cell lines[j]. int jurol,2001,8(7):3539.