高效液相色谱法测定毛冬青酸在大鼠体内的血药

作者：林朝展，蔡昭喜，桂浩凌，祝晨蔯，张翠仙，赵钟祥

【摘要】 【目的】建立在大鼠血浆中测定毛冬青酸血药浓度的方法。【方法】大鼠尾静脉注射毛冬青酸后,依一定的时间间隔,自颈动脉采血,分离血浆,经氯仿沉淀蛋白后,以乙腈—体积分数02%磷酸为流动相,色谱柱为kromasil 1005 c18(250 mm×46 mm,5 μm),流速为10 ml/min;柱温为30℃;紫外检测波长为203 nm。【结果】本研究方法在204～510 μg/ml范围内线性关系良好,低、中、高3个浓度的回收率为935%～948%,日内精密度sr为15%～45%、日间精密度sr为27%～111%。【结论】经过系统的方法学考察,本研究所建立的测定方法灵敏度较高、重现性良好,可用于血浆中毛冬青酸的含量测定。

【关键词】 毛冬青/化学;毛冬青酸/分析;血药浓度;色谱法，高压液相

　毛冬青为冬青科冬青属植物毛冬青ilex pubescem arm的干燥根,是我国南方常用中药,具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒的功效,在临床上广泛用于治疗冠心病、心绞痛和脉管炎等疾病[1]。近年来,有关冬青属化学成分的研究取得了很大进展,从中得到一系列新化合物,冬青属植物药理活性的研究也有不少进展。有关毛冬青药理作用的报道主要集中在抗心肌缺血作用、抗血小板作用以及预防肾衰竭等方面[2-7]。

　　毛冬青酸(ilexolic acid,ila)是从毛冬青根中分离得到的一种五环三萜酸。目前,国内外对ila的药物动力学研究及其在体内外的代谢研究尚未见文献报道。本文采用高效液相色谱(hplc)法测定大鼠尾静脉注射毛冬青酸后不同时间点的血药浓度,以期为毛冬青酸在体内的代谢研究提供依据,现报道如下。

　　1材料

　　11仪器anke tdl5a离心机(上海安亭仪器有限公司),bp211d电子分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司),waters 515泵(美国waters公司),waters2487双波长紫外检测器(美国waters公司),n3000色谱工作站(南京艾赛特科技发展有限公司),axw5柱温箱(大连依利特分析仪器有限公司)。

　　12试药毛冬青酸为自制,其纯度经hplc峰面积归一化法检测,含量高于99%,符合含量测定要求。人参皂苷rg1购自中国药品生物制品检定所,批号：0623，色谱纯乙腈、甲醇均为merk 公司产品，纯净水为自制,其他试剂均为国产分析纯。

　　13实验动物wistar大鼠,spf级,雄性,体质量180～220 g,由广东省医学实验动物中心提供，合格证号： scxk(粤)200300020044109。

　　2方法与结果

　　21色谱条件kromasil 1005 c18(250 mm×46 mm,5 μm);保护柱：analytical guard cartridge system (phenomenex, usa);流动相由乙腈(a)和体积分数02%磷酸(b)2相组成,二元梯度洗脱程序按a相比例条件,a：20%～30%(0~5 min),a：30%～50%(5~15 min),a：50%～74%(15~23 min),a：74%～20%(23~25 min);流速为10 ml/min;柱温为30℃;紫外检测波长为203 nm。

　　22标准溶液制备

　　221对照品溶液取毛冬青酸对照品适量,精密称定,加流动相配制成浓度为102 μg/ml的对照品储备液,备用。

　　222内标溶液取人参皂苷rg1对照品适量,精密称定,加流动相配制成浓度为108 μg/ml的对照品储备液,然后再配制成浓度为216 ng/ml的内标对照品溶液,备用。

　　23血浆样品预处理

　　231空白血浆供试样品溶液取空白组大鼠血浆样品200 μl,置5 ml具塞离心试管中,加入氯仿2 ml,涡旋液体混合器上振荡1 min,3 000 r/min离心10 min,分离有机相,37℃水浴上n2吹干,加入100 μl流动相复溶,涡旋振荡30 s,5 000 r/min离心5 min,取上清液进样20 μl,液相图谱见图1a。

　　232加药空白血浆供试品溶液取空白组大鼠血浆样品200 μl,分别精密加入毛冬青酸对照品溶液100 μl和内标溶液200 μl,置5 ml具塞离心试管中,加入氯仿2 ml,涡旋液体混合器上振荡1 min,3 000 r/min离心10 min,分离有机相,37℃水浴上n2吹干,加入100 μl流动相复溶,涡旋振荡30 s,5 000 r/min离心5 min,取上清液进样20 μl,代表性图谱见图1b。

　　233含药血浆供试品溶液取给药后大鼠血浆样品200 μl,精密加入内标溶液200 μl,置5 ml具塞离心试管中,加入氯仿2 ml,涡旋液体混合器上振荡1 min,3 000 r/min离心10 min,分离有机相,37℃水浴上n2吹干,加入100 μl流动相复溶,涡旋振荡30 s,5 000 r/min离心5 min,取上清液进样20 μl,代表性图谱见图1c。图1血浆样品的高效液相色谱图

　　24分析方法系统考察

　　241标准曲线的制备准确吸取毛冬青酸标准溶液(102 μg/ml)2、5、10、20、30、40、50 μl至5 ml具塞离心试管中,加入大鼠空白血浆至200 μl,混匀,按23项下方法操作,以毛冬青酸的血药浓度为横坐标,毛冬青酸与内标物的峰面积比为纵坐标,用最小二乘法进行线性回归,每个浓度平行进行3个样本的分析,结果表明,毛冬青酸在204～510 μg/ml范围内线性关系良好, 回归方程为y=0110 6 x-0048 8,γ=0997 8。

　　242精密度实验

　　2421日内精密度分别取毛冬青酸标准溶液10、20、40 μl,加入大鼠空白血浆至200 μl,混匀,按23项下方法操作,每间隔2 h进样测定1次,共测定6次。结果见表1。　表 1毛冬青酸血药浓度测定的日内精密度考察

　　2422日间精密度分别取毛冬青酸标准溶液10、20、40 μl,加入大鼠空白血浆至200 μl,混匀,按23项下方法操作,每间隔24 h进样测定1次,共测定6次。结果见表2。　表2毛冬青酸血药浓度测定的日间精密度考察

　　243稳定性实验分别取毛冬青酸标准溶液10、20、40 μl,加入大鼠空白血浆至200 μl,混匀,制成低、中、高3个浓度的血浆样品,按23项下方法操作测定浓度。室温放置24 h后进行测定(每浓度3样本),考察其稳定性。结果显示：所有室温放置试验测定值的低、中、高浓度的sr值分别为62%、24%、49%,符合精密度要求,说明分析测试过程中的样品较为稳定。样品4℃放置48 h后,重新测定样品浓度。结果显示：所有长期稳定性试验测定值的低、中、高浓度的sr值分别为87%、49%、61%,均小于15%,符合精密度要求,表明冷冻放置血浆样品,不影响本方法对样品浓度进行准确测定。

　　244回收率实验

　　2441分析方法的回收率分别取毛冬青酸标准溶液10、20、40 μl,加入大鼠空白血浆至200 μl,混匀,制成低、中、高3个浓度的血浆样品,按23项下方法操作,每个浓度平行3个样本的分析,依回归方程计算测得量,按测得量与加入量之比,计算分析方法的回收率,结果见表3。

　　2442提取方法的回收率分别取毛冬青酸标准溶液10、20、40 μl,加入大鼠空白血浆至200 μl,混匀,制成低、中、高3个浓度的血浆样品,按23项下方法操作,计算待测物与内标物的峰面积比(aim/ais)a;另取相同浓度的标准溶液50 μl,加入内标150 μl后进样,计算待测物与内标物的峰面积比b,以b/a×100%计算得该浓度下药物的提取方法回收率,每个浓度平行3个样本的分析,结果见表 4。表 3毛冬青酸血药浓度测定方法的回收率表4毛冬青酸血药浓度测定提取方法的回收率(n=9)

　　25大鼠血浆中毛冬青酸血药浓度测定选用禁食12 h自由饮水的大鼠10只,取02 ml空白血浆后,以剂量为100 mg/kg尾静脉注射给予毛冬青酸,于给药后不同时间点(5、10、15、20、25、30、60、90、120、150、180 min)由颈动脉各取血02 ml,精密加入内标溶液200 μl,依233项下方法测定毛冬青酸的含量。血浆中毛冬青酸浓度—时间曲线见图2。

　　3讨论

　　前期研究[8]结果表明：毛冬青酸是毛冬青中的主要成分之一,也是毛冬青皂苷类成分在体内的主要代谢产物之一。体外药理活性试验研究[9]显示具有28位游离羧酸的五环乌苏烷型三萜类化合物具有很好的抑制锥体虫活性。因此,建立毛冬青酸在体内的含量测定方法,能为后续毛冬青皂苷类化合物的体内药代动力学研究提供基础资料和可靠依据,故而选择其作为指标成分。

　　由于实验动物存在个体差异,给药后血药浓度相差较大,因此选择与毛冬青酸结构较为相近的人参皂苷rg1作为内标,通过比较空白血浆、空白血浆加毛冬青酸与内标、含药血浆的色谱图,表明血浆中内源性物质对样品测定无干扰,方法选择性较好,同时经过系统的方法学考察,所建立的测定方法灵敏度较高、重现性良好。

　　本研究结果表明毛冬青酸尾静脉给药在大鼠体内分布迅速,代谢很快,给药30 min左右血药浓度即达极低水平,在0～3 h的时间段内,毛冬青酸在血液中均有分布。本结果可为毛冬青有效成分在体内的代谢研究提供依据。

【参考文献】
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　　[6] 黄才,梁念慈. 毛冬青和复方丹参注射液对猪血小板骨架蛋白的影响[j].江西中医学院学报，1993,11(1-2)：9.

　　[7] 孟广森,邓勇,郑有顺,等.毛冬青地上部分对大鼠冠脉流量的影响及抗心肌缺血作用[j].中药药理与临床，1996,12(3)：34.

　　[8] 张翠仙,杨金燕,林朝展,等. 毛冬青中三萜类化合物的nmr归属[j].中山大学学报(自然科学版)，2009,48(1)：42.

　　[9] teketaa t c,gnoatto s c b， gosmann g,et al. triterpenoids from brazilian ilex species and their in vitro antitrypanosomal activity [j]. j nat prod, 2004, 67: 1697.

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