鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化

作者：董燕，来慧丽，张雅明，周联，王培训

【摘要】 【目的】建立鱼腥草离体再生系统和农杆菌介导的遗传转化方法。【方法】以鱼腥草叶片为外植体置于不同激素配比的ms培养基上，进行愈伤组织诱导和分化再生。以根癌农杆菌eha105/pcambia13052进行转化，将外源gus(β葡萄糖醛糖苷酶)基因、潮霉素抗性基因转入鱼腥草，以组织化学染色法检测gus活性，以聚合酶链反应(pcr)法鉴定基因组中的gus基因。【结果】 ms培养基中添加01 mg/l α奈乙酸(naa)、20 mg/l 6其基腺嘌呤(6ba)、05 mg/l呋喃氨基嘌呤(kt)适于鱼腥草叶片为外植体进行离体再生，出芽率达967%。潮霉素作为筛选试剂，浓度为25 mg/l;头孢霉素作为抑菌剂，浓度为250 mg/l。经感染的外植体中gus 反应呈阳性的占750 %;8周统计抗性芽比率55%，pcr分析表明gus基因已整合到鱼腥草基因组中。【结论】通过鱼腥草离体培养条件的研究及根癌农杆菌介导的遗传转化，获得了较高的离体再生频率，实现了鱼腥草的遗传转化。

【关键词】 鱼腥草/生长和发育;离体再生;遗传转化;根癌农杆菌

鱼腥草为三白草科植物蕺菜(houttuynia cordata thunb)的全草，是多年生的草本植物，具清热解毒、消痈排脓、利尿通淋等功效，在我国许多地区均有大面积人工栽培。鱼腥草生长旺盛，易于离体培养，是较好的转基因受体材料，而目前未见鱼腥草转基因报道。本研究以鱼腥草叶片为外植体，通过离体再生和农杆菌介导的基因转化建立了鱼腥草遗传转化系统，为鱼腥草种质资源优化或作为生物反应器生产药用蛋白打下基础，现报道如下。

　　1材料与方法

　　11植物材料鱼腥草无菌苗，自广州中医药大学药圃取鱼腥草植株的茎尖，自来水冲洗10 min，用体积分数75%酒精浸泡30 s，1 g/l升汞浸泡8～10 min，无菌水冲洗6～8次，接种于ms培养基上，25℃～28℃，光照14 h/d，光照度2 000 lx，培养无菌苗。

　　12质粒和菌株质粒pcambia13052和根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)eha105菌株均由华南农业大学刘耀光教授惠赠，根癌农杆菌工程细胞eha105/pcambia13052为本室构建。质粒pcambia13052 携带β葡萄糖醛糖苷酶报告基因(gus)，具有潮霉素抗性基因(植物选择标记)和卡那霉素抗性基因(细菌选择标记)。

　　13主要试剂与仪器植物激素α奈乙酸(naa)、呋喃氨基嘌呤(kt)、6苄基腺嘌呤(6ba)和头孢霉素(cefotaxine)均购于广州威佳生物技术公司,卡那霉素(kanamycin)和羧苄青霉素(carbenicillin)为美国sigma公司产品,氯霉素(chloramphenicol)为mebchem公司产品,潮霉素(hygromycin，hyg)为德国roche公司产品,植物基因组dna提取试剂盒(dp305)为天根生化科技(北京)有限公司产品，500 bp dna ladder为宝生物(大连)有限公司产品，乙酰丁香酮(acetosyringone，as)为美国mebchem产品,5溴4氯3吲哚βd葡萄糖苷酸酯(xgluc)为美国ameresco公司产品。2720型聚合酶链反应(pcr)扩增仪为美国abi公司产品，gds7500凝胶成像及分析系统为英国uvp公司产品。

　　14培养基基本培养基为ms，用于无菌苗的培养。在基本培养基中添加植物激素用于离体再生，加入一定量抗生素用于筛选培养。lb培养基用于农杆菌培养。

　　15gus基因转化鱼腥草取无菌苗的叶片，切下直径为5 mm的叶圆片，叶面朝上置于培养基上，避光预培养2 d。挑取eha105/pcambia13052农杆菌单菌落，接种于3 ml lb液体培养基(含17 mg/l氯霉素和100 mg/l卡那霉素)中，28℃、200 r/min，振荡培养24h后，取1 ml菌液，接种到30 ml lb液体培养基中，振荡培养至d600为03～04时，将预培养2 d后的叶圆片浸没于菌液中侵染叶片15 min，取出后置于无菌滤纸上吸去附着的菌液，置于添加100 μmol/l乙酰丁香酮的ms培养基上，避光共培养2 d，转入筛选培养基上再避光培养7 d后，进行光照培养。培养温度25℃～28℃，光照14 h/d，光照度2 000 lx。

　　16gus活性的组织化学鉴定参照《植物分子生物学实验指南》[2]，采用gus组织化学染色法检测β葡萄糖醛糖苷酶活性。

　　17gus基因整合鉴定采用文献报道[1]的gus基因片段的引物序列如下：上游引物：5’gtggaattgatcagcgttgg3’;下游引物：5’atcggcatgaacttcggtg3’，委托上海生物工程技术有限公司合成。以植物dna提取试剂盒提取抗性植株总dna，以gus 上、下游引物进行pcr鉴定：94℃变性5 min后进入pcr循环，即94℃、1 min，59℃、1 min，72℃、1 min，35个循环，72℃延伸7 min。

　　2结果与分析

　　21不同激素组合对鱼腥草离体再生的影响

　　采用添加不同激素组合的ms培养基进行以鱼腥草叶片为外植体的离体培养(见表1)，结果显示单独添加2,4d时出愈率高，但不分化。添加naa和6ba可诱导愈伤并出芽，而同时添加2,4d时出愈率提高，但不出芽，说明2,4d有利于愈伤组织的形成，但抑制再生出芽。在naa、6ba组合中再添加kt可明显提高出芽率，表明kt有利于出芽。确定添加01 mg/l naa、20 mg/l 6ba、05 mg/l kt适于鱼腥草离体再生，培养1周开始出现愈伤组织颗粒，培养3周分化出芽，待芽长至2cm左右从外植体上切下，转至ms基本培养基中诱导生根(图1)。表1激素对鱼腥草离体再生的影响

　　22筛选培养中潮霉素浓度确定质粒pcambia13052上有潮霉素(hyg)抗性植物选择标记。取鱼腥草切下的叶圆片在hyg浓度分别为0、25、50、75 mg/l的筛选培养基上培养5周，观察愈伤组织芽分化的情况，当hyg浓度为25 mg/l时，鱼腥草有愈伤组织，但极少有芽分化，浓度为50 mg/l时，愈伤组织很少且无芽分化，大部分叶片出现萎黄，失去活力。因此，采用25 mg/l hyg的较低浓度进行前期筛选，以利于植物组织的活力，8周后采用50 mg/l hyg筛选以减少假阳性植株。

　　23抑菌剂的确定植物材料受到农杆菌侵染后，需要抗生素及时有效地抑制、杀死农杆菌，以防农杆菌的大量繁殖影响植物细胞的生长和分化，且抗生素对植物组织培养具有抑制作用，因此筛选出合适的抗生素及使用浓度对后续的转化十分必要。本研究通过抑菌圈实验比较头孢霉素与羧苄青霉素对农杆菌eha105的抑菌效果和使用浓度。结果表明，羧苄青霉素对农杆菌eha105的抑菌效果不明显，没有明显抑菌圈产生。头孢霉素在浓度大于250 mg/l时，对农杆菌eha105有明显抑制。而且通过抗生素耐性实验确定250 mg/l头孢霉素对鱼腥草的生长活性无明显影响。因此在筛选培养时添加250 mg/l头孢霉素抑制农杆菌的生长。

　　24根癌农杆菌介导转化和抗性植株再生经比较农杆菌浓度、侵染时间以及预培养时间、共培养时间等对转化的影响，确定鱼腥草叶圆片预培养2 d，以d600为03～04的活化农杆菌侵染15 min，转入添加100 μmol/l as的培养基中共培养2 d，转至添加25 mg/l hyg和250 mg/l头孢霉素的筛选培养基上，受侵染叶片能较好产生愈伤组织并分化。愈伤颗粒约2周开始长出，6周开始分化出芽，8周统计抗性芽比率55%的外植体分化出芽并保持活力。

　　25gus基因检测质粒pcambia13052 携带gus基因带有内含子序列，其表达产物β葡萄糖醛糖苷酶作用于底物xgluc时，将无色的底物水解产生出深蓝色的5溴4氯靛蓝，用组织化学染色定位法可快速检测gus基因的瞬时表达。农杆菌侵染外植体3 d后取部分外植体进行gus 基因瞬时表达活性的检测，结果经转化的75 %的叶圆片显蓝色，未经转化处理的对照无任何蓝色反应，说明gus基因已转入鱼腥草组织细胞并表达。对再生抗性植株总dna的pcr分析中(图2)，转基因植株中可获得大小约18 kb的pcr产物，与预期相符，结果表明gus基因已整合到鱼腥草基因组中。

　　3讨论

　　董燕，等.鱼腥草离体再生及农杆菌介导的遗传转化第1期通过农杆菌介导法获得的转基因药用植物已有多种，而鱼腥草作为一种兼有药用和食用价值、已被大面积栽培的药用植物还未见此方面的报道。建立一个高效稳定的离体再生系统，是鱼腥草遗传转化的先决条件。鱼腥草具有再生能力强、再生方式多样的特点，主要以茎节、茎尖和带侧芽茎段为外植体诱导形成愈伤组织,再分化形成丛生芽进行快速繁殖[3-5]，虽有以叶片为外植体的研究，但培养周期较长[6]。本试验建立了以鱼腥草叶片作为外植体诱导愈伤组织并分化的再生体系，具有培养周期短、再生率较高的优点，不仅为鱼腥草离体再生提供了新途径，也为鱼腥草遗传转化工作的开展及转化效率的提高创造了条件。

　　在以农杆菌工程细胞eha105/pcambia13052介导外源基因转化鱼腥草的研究中，将报告基因gus和植物选择标记潮霉素磷酸转移酶基因(hygromycin b phosphotransferase，hpt)导入鱼腥草，使转化细胞具有潮霉素抗性。用组织化学染色法快速检测gus基因的瞬时表达，鉴定gus基因已转入鱼腥草植物细胞内，对再生抗性植株基因组的pcr分析初步证明gus基因已整合到鱼腥草染色体中，说明已初步建立农杆菌介导的鱼腥草遗传转化系统，为利用基因工程技术进行鱼腥草新品种的开发、种质资源的优化奠定了基础。

【参考文献】
　　[1]叶华，王娴，王敬乔，等带植物内含子的gus 基因强表达载体的构建[j]思茅师范高等专科学校学报， 2005, 21(3): 1

　　[2]p 马利加, d f克莱森, w 格瑞森姆 植物分子生物学实验指南[m] 北京：科学出版社，2000: 47

　　[3]tauzuki k， miyasita s，kono n，et al report on the plant regeneration from the callus made of the leaf segments of houttuynia cordata thunb.[j] bulletin of nippon veterinary and animal science university, 1995,44: 65

　　[4]handique p j in vitro regeneration of a medicinal plant houttuynia cordata thunbfrom nodal explants[j] current science, 1999, 76(9): 1245

　　[5]吴卫,郑有良,刘凡鱼腥草新品系离体培养和快速繁殖[j]中国中药杂志, 2004,29(1): 24

　　[6]王莲,袁艺鱼腥草体细胞胚胎发生和植株再生[j]激光生物学报,2007,16(6):722

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