MMP9基因多态性与老年动脉僵硬度的相关性研究

【摘要】 目的 探讨老年动脉僵硬度与基质金属蛋白酶9(mmp9)基因多态性的相关性。方法 对437例老年人(年龄60～95岁)进行一般情况、实验室指标及臂踝脉搏波传导速度(bapwv)的检测，并综合bapwv值及年龄bapwv曲线，分为低bapwv组和高bapwv组。应用pcr限制性片段长度多态性(rflp)法确定基因型，分析比较两组mmp9三种基因型的分布。结果 高bapwv组tt基因型频率(16.4%)明显高于低bapwv组(8.8%)，两组差异有显著统计学意义(χ2= 6.470,p= 0.008)。两组t等位基因分布有显著统计学意义(χ2= 7.929,p= 0.003 )。mmp9三种基因型中以c/c型作为比较基线，c/t型和t/t型的or分别为1.227(95%ci：0.793～1.899)和2.170(95%ci:1.184～3.976)。以c等位基因作为比较基线，t等位基因的or为1.550(95%ci:1.141～2.105)。经单因素非条件logistic回归分析后进行多因素非条件logistic回归分析，结果显示年龄、体重指数、收缩压、脉压、平均动脉压、吸烟、高密度脂蛋白(hdl)及mmp9 tt基因型为动脉僵硬度增加的危险因素。结论 老年动脉僵硬度与mmp9基因多态性密切相关，mmp9 基因1 562t等位基因可能是老年动脉僵硬增高的遗传基因标记之一。

【关键词】 老年;动脉僵硬度;基质金属蛋白酶9;基因多态性

基质金属蛋白酶9(mmp9) 是基质金属蛋白酶家族(mmps) 中明胶酶的一种，作为降解血管基底膜中ⅳ型胶原的主要酶类,与动脉僵硬度密切相关。9 c1 562t 是mmp9基因转录启动子上游1 562 bp处存在的c →t 的功能多态性,影响基因转录产生低活性(c/c)和高活性(c/t、t/t) 的启动子基因型。臂踝脉搏波传导速度(bapwv)是反映动脉僵硬度的良好指标， mmp9 c1 562t 基因变异的功能多态性与血压正常者的动脉僵硬程度相关〔1〕。本研究应用聚合酶链反应限制性片段长度多态性(pcrrflp)技术，分析mmp9 c1 562t 基因多态性在山东地区老年人中的分布特点,探讨mmp9基因c1 562t多态性与老年动脉僵硬度的关系。

　　1 研究对象与方法

　　1.1 研究对象 选取山东地区老年人437例,年龄60～95岁。同一医师应用日本科林公司vp1000 动脉硬化测定仪测定受试者bapwv。根据bapwv〔2〕及年龄bapwv曲线分为低bapwv组和高bapwv组。低bapwv组217例，平均年龄(66.1±5.6)岁;高bapwv组220例，平均年龄(68.3±8.4)岁。排除标准：继发性高血压、感染、肿瘤、糖尿病、全身免疫性疾病、严重肝肾疾病者。所有研究对象均来自汉族人群,无血缘关系。

　　1.2 方法 mmp9基因c1562t多态性检测。dna抽提：采肘静脉血5 ml，edta 抗凝,采用低渗盐析法从白细胞中抽提基因组dna，核酸分析仪测定dna浓度，-80℃保存。pcr扩增：mmp9 c1 562t位点及其侧翼区：引物由博尚生物技术公司合成，上游引物5′gcc tgg cac ata gta ggc cc3′;下游引物5′ctt cct aga cag ccg gca tc3′。pcr总反应体系为10 ×buffer 3 μl，mgcl2(25 mmol/ l) 1.2 μl,dntp (各10 mmol/l) 0.6 μl,上下游引物各3 μl，dna 模板1 μl，taq dna 聚合酶〔(宝生物工程(大连)有限公司〕1 u，加双蒸水至总体积30 μl 。pcr 反应条件:94℃预变性5 min，94 ℃1 min、68℃ 1 min、72 ℃1 min 35个循环;最后72 ℃延伸5 min。取pcr产物8 μl，1.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪检测pcr 产物特异性。 pcr产物的酶切分析：产物回收，纯化，取10 μl 纯化pcr产物，加限制性内切酶paeⅰ(由fermentas mbi 公司提供)10 u，10 ×buffer 3 μl，加双蒸水至总反应体系30 μl， 置于37℃温浴酶切2 h，2.5%琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外分析仪检测酶切产物基因型。对其中部分病例的pcr 扩增产物,进行切胶纯化,于abi 377 型全自动测

　　序仪上作dna序列测定,验证c1 562t位点碱基。等位基因频率= (2×纯合子数+ 杂合子数)/(2×受检人群) 。

　　1.3 统计学处理 所有统计资料均输入计算机，用spss11.5软件分析，计量资料采用x±s表示，计数资料用百分数表示。基因型和等位基因频率用基因计数法,等位基因频率比较及检验基因型频率与hardyweinberg平衡定律符合程度,均用χ2检验。组间一般资料及生化指标的比较采用单因素方差分析、t检验或χ2检验及相关分析等。用多因素logistic 回归分析不同基因型与动脉僵硬发生的关系和消除混杂因素。关联程度用优势比(or) 及其95%可信区间(ci) 表示。

　　2 结 果

　　2.1 一般临床资料 高bapwv组总胆固醇、血糖明显高于低bapwv组(p<0.05)，其他临床资料两组差异无显著性(p>0.05)，见表1。表1 两组一般临床资料　bmi:体重指数;sbp：收缩压;dbp:舒张压;pp：脉压;map:平均动脉压;tc：总胆固醇;tg:甘油三酯;glu:血糖;hdlc：高密度脂蛋白胆固醇

　　与低bapwv组比较:1)p<0.05

　　2.2 pcrrflp检测mmp9多态性 应用pcr技术成功扩增到长度为435 bp的特异性片段，经限制性内切酶pae ⅰ酶切后产生野生型435 bp(c/c)，杂合子435 bp、247 bp、188 bp(c/t)，纯合突变247 bp、188 bp(t/t)三种基因型，见图1。

　　图1 mmp9 pcr扩增产物及酶切产物电泳结果

　　2.3 基因测序验证mmp9基因位点 部分pcr产物纯化后测序结果见图2。mmp9 1562位c→t突变共检测了437例，见表2。低bapwv组217例，c/c型、c/t型和t/t型分别占65.4%、25.8%和8.8%;高bapwv组220例，c/c型、c/t型和t/t型分别占56.4%、27.3%、16.4%。经hardyweinberg检验本组样本具有较好的代表性。低bapwv组和高bapwv组中的tt基因型分布差异有非常显著统计学意义(χ2= 6.470,p= 0.008)。ct基因型分布差异无统计学意义(χ2= 0.844,p= 0.210)。两组t等位基因分布有显著统计学意义(χ2= 7.929,p= 0.003 ) mmp9三种基因型中以c/c型作为比较基线，c/t型和t/t型的or分别为1.227(95%ci：0.793～1.899)和2.170(95%ci:1.184～3.976)。以c等位基因作为比较基线，t等位基因的or为1.550(95%ci:1.141～2.105)。表2 mmp9基因型及等位基因频率分布

　　2.4 回归分析 以年龄、性别、bmi、sbp、dbp、pp、map、吸烟、tc、tg、hdl、ldl、glu为自变量，以是否发生动脉硬化为因变

　　量进行单因素非条件logistic回归分析后进行多因素非条件logistic回归分析，显示年龄(p<0.01，or= 2.543，95% ci:1.642～3.521)，bmi(p<0.01,or= 2.749，95% ci:1.781～4.245)，sbp(p<0.01,or= 1.884，95% ci:1.320～2.687)，pp(p<0.05,or= 1.834，95% ci:1.209～2.781)，map(p<0.01,or= 2.853，95% ci：1.796～4.531)，吸烟(p<0.05,or=1.807，95% ci:1.706～1.892)，hdl(p<0.01,or= 0.566，95% ci:0.477～0.698)及mmp9 tt基因型(p<0.01，or= 2.409，95% ci:1.606～3.613)为动脉僵硬度增加的危险因素。

　　3 讨 论

　　mmps是细胞外基质(ecm)中主要的蛋白质成分，为ecm降解所必需，自1962年gross和lapiere首次报道以来，目前已发现至少20种成员，其中mmp9在心血管系统ecm重塑中具有重要作用。mmp9，又称为明胶酶b或92 kd明胶酶，可降解i、v型明胶和iv、v型胶原。人mmp9基因位于20 q11.2q13.1，全长7.7 kb，含有13 个外显子和12 个内含子,编码92 ku蛋白。其启动子中已发现在mmp9 基因中存在多个序列变异,其中关于c1 562t 多态位点的研究报道较多。mmp9 c1 562t 是mmp9 基因转录启动子上游1 562处c被t取代,而包含此多态性位点的9 bp序列gcgcac/tgcc(-1 567 →-1 559) 是一个重要的调控元件,可能是转录抑制蛋白的结合位点。当c→t 后,dna蛋白的相互作用被消除,从而影响基因转录，产生出低活性(c/ c) 和高活性(c/ t、t/ t)的启动子基因型〔3〕。体外转载实验及血浆mmp9 含量的测定均证明了这一点〔4〕。

　　有报道证实〔5〕此多态性和经冠状动脉造影而确诊的冠状动脉疾病患者大动脉僵硬度相关。携带t基因型的个体(c/t，t/t)不论是大动脉僵硬度还是颈动脉pp、sbp都比c/c基因型的患者高。这种相关性在调整了年龄，性别，map，tc，lpl后仍然明显。携带mmp9基因1562t等位基因者mmp9蛋白表达较 1 562c明显增高。segura等〔6〕在对心脏移植患者的主动脉组织中mmp9的研究发现，t基因携带者的个体其mmp9基因表达是c基因携带者的5倍。在t基因携带者中无论是mmps本身还是其活性都是升高的。国内罗明等〔7〕证实mmp9 在高血压合并2 型糖尿病患者颈动脉粥样硬化发生发展过程中亦起重要作用。王浩等〔8〕研究发现mmp9在心肌梗死患者发病的重要的炎性因子。

　　yasmin等〔1〕研究证实，健康人t等位基因携带者无论是血浆mmp9还是主动脉脉搏传导速度都高于其他基因型，经过调整了其他因素后mmp9 c1 562t多态性 与其大动脉僵硬度仍然相关。研究发现〔9，10〕,mmp9水平可能与高血压患者发生心血管事件的危险性相关，并和心血管疾病患者的动脉僵硬度相关。tan等〔11〕对202例原发性高血压患者与年龄和性别相匹配的50例正常人进行研究显示，高血压患者血浆mmp9水平显著高于低bapwv组，且相关分析显示其与颈股脉搏波传导速度显著相关。 lehoux 等〔12〕发现mmp9在高血压早期血管重塑中起重要作用。故推测t等位基因能增强mmp9启动子的活性，高活性的(c/ t、t/ t)可能通过上调 mmp9的表达，从而使动脉僵硬度增加。mmp9如何重塑血管进而导致动脉僵硬度增加，有待于进一步探讨。

　　本研究结果显示，低bapwv组和高bapwv组tt基因型为8.8%、16.4%，两组比较差异有统计学意义。tt基因型发生动脉硬化的几率是cc基因型的2.170倍。与低bapwv组t等位基因相比，动脉高bapwv组t等位基因频率显著增高，趋势检验显示t等位基因携带者发生动脉硬化的危险是c等位基因的1.550倍。提示t等位基因可能与高血压患者动脉硬化有关，可能是高血压患者动脉僵硬度增加的遗传易感因素之一。经相关分析证实，年龄、bmi、sbp、pp、map、吸烟、hdlc、mmp9 tt基因型为动脉僵硬度的影响因素。原发性高血压动脉僵硬度与mmp9基因多态性可能相关，mmp9基因c1 562t多态性在高血压患者动脉僵硬过程中的具体作用有待于进一步结合血浆及组织中mmp9含量，动脉僵硬程度，及临床资料相联系进行大规模的研究。

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