MicroRNA—146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应方法分析

　作者单位：276003山东省临沂，临沂市人民医院重症医学科（张建国、陈晓娟）;南昌大学第一附属医院重症医学科（丁成志、邵强、曾振国、刘芬、钱克俭）
　　通信作者：钱克俭，Email：qkj0607@
　　microRNA是一类大小约22个核苷酸长度的内源性非编码小分子RNA，主要通过识别并结合靶基因 mRNA 的3’端非编码区，在转录后水平抑制蛋白的翻译或促进靶基因的降解。有研究发现微小RNA参与肺内炎症反应的调控，miR-146a是其中较有代表性的一个。本课题组前期研究发现，用LPS刺激肺泡巨噬细胞，miR-146a的表达水平升高，并且升高程度与TNF-α mRNA呈负相关;转染miR-146a能下调LPS诱导肺泡巨噬细胞TNF-α的表达，表明miR-146a能抑制LPS诱导肺泡巨噬细胞的炎症反应。本实验拟进一步探讨miR-146a调控肺泡巨噬细胞炎症反应的机制，为体内试验提供理论依据。
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　大鼠肺泡巨噬细胞NR8383（上海中国科学院细胞库）;LPS（ 0111：B4）;Pre-miRTM miR-146a前体、CyTM3标记的Pre-miRTM阴性对照（美国ABI公司）;大鼠 TNF-α ELISA 检测试剂盒（上海森雄科技实业有限公司） ; PrimeScript逆转录试剂盒、SYBR荧光染料试剂Ⅱ（SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ）PCR 检测试剂盒（大连宝生物工程有限公司）;抗IRAK-1 抗体，抗TRAF-6 抗体、抗NF-κB p65抗体（美国abcam公司）。
　　1.2实验分组及处理
　　将体外培养的 NR8383 细胞按每孔1.5×106个接种至6孔板，每孔2 mL，每组2个复孔。转染组转染50 nmol/L的Pre-miRTM miR-146a前体，对照组转染50 nmol/L 的 CyTM3 标记的 Pre-miRTM 阴性对照，摇匀后继续培养24 h，随后加入1 μg/mL 终质量浓度的 LPS 处理细胞6 h，离心收集细胞和上清液，-80 ℃保存。
　　1.3检测指标及方法
　　1.3.1免疫荧光法观察 NF-κB p65 核移位情况将细胞爬片放置于24孔板;甲醇丙酮固定细胞，0.5%TritonX-100 PBS 透化细胞;再放入含10%驴血清的 PBS 中4 ℃封闭;孵育一抗：用0.5%TritonX-100 PBS稀释兔抗 NF-κB p65（1∶50），常温下孵育4 h后漂洗;孵育二抗：用10%驴血清的 PBS 稀释 Alexa Flour 488 驴抗兔绿色荧光标记二抗（1∶200），室温下孵育20 min后漂洗;用 Dapi 染核，滴加防荧光粹灭剂、固定封片，在Olympus IS71倒置荧光显微镜下拍照分析。
　　1.3.2ELISA 检测 TNF-α 蛋白含量收集细胞上清液，按照 ELISA 试剂盒操作说明书步骤操作检测 TNF-α 蛋白含量。
　　1.3.3RT-qPCR 检测 IRAK-1、TRAF-6 及TNF-α mRNA 表达采用 TRIzol 法提取细胞内总 RNA，通过紫外分光光度计测定总 RNA 浓度，琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 完整性及纯度。按照 PrimeScript逆转录试剂盒说明书操作，所有操作均在冰上完成。10 μL 的逆转录反应体系：PrimeScript 缓冲液 2μL，PrimeScript 逆转录酶复合物 10.5 μL，多聚胸腺嘧啶引物 0.5 μL，随机的6核苷酸引物 0.5 μL，总RNA 500 ng，加无核酶水至总体积10 μL。反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。20 μL 的 PCR反应体系包括：cDNA 2 μL，上游引物 0.8 μL，下游引物 0.8 μL，SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，无核酶水6 μL。反应条件：95 ℃ 30 min，40个扩增循环（95 ℃ 5 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 27 s）。选取β-actin 作为内参，检测IRAK-1 mRNA、TRAF-6 mRNA及TNF-α mRNA的表达，相对表达量采用2-ΔΔCt计算。引物序列及长度见表1。
　　1.3.4IRAK-1、TRAF-6、NF-κB p65 蛋白表达收集细胞，离心，弃上清，提取总蛋白或分别提取胞核蛋白、浆蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。完成聚丙烯酰胺凝胶电泳（每孔加样20 μL）、转膜、封闭，孵育一抗，兔抗 IRAK-1（1∶2000）、兔抗 TRAF-6 （1∶1000）、兔抗 NF-κB p65（1∶500）和鼠抗 β-actin（1∶3000）/兔抗 Lamin B1（1∶1000），4 ℃孵育过夜，漂洗3次;孵育二抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 、山羊抗鼠 IgG（1∶4000），37 ℃孵育1-2 h，漂洗3次，暗室内曝光、显影并定影，行X胶片扫描，通过 Quantity One 软件进行数据分析，检测 IRAK-1、TRAF-6及胞浆NF-κB p65蛋白以 β-actin 作为内参，细胞核内NF-κB p65蛋白以 Lamin B1作为内参。
　1.4统计学方法
　　采用 SPSS 17.0 统计软件分析数据，数据以均数±标准差（x±s）表示，两样本比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2结果
　　2.1过表达 miR-146a 对 LPS 诱导的 NR8383 细胞 NF-κB p65 核移位的影响
　　2.1.1免疫荧光法观察细胞 NF-κB p65 核移位的变化倒置荧光显微镜下观察到NF-κB p65 呈绿色荧光，Dapi 染核后呈蓝色荧光。与对照组比较，观察到转染组 NF-κB p65 胞核中表达减少，胞浆中增多。见图1。
　　2.2过表达 miR-146a 对 LPS 刺激的NR8383细胞 TNF-α表达的影响
　　 与对照组相比较，RT-qPCR 检测NR8383细胞转染miR-146a后TNF-α mRNA表达下调至（0.47±0.06）倍（P<0.05）;ELISA 检测TNF-α蛋白表达也明显下降（211.5±30.39）pg/mL vs.（616.6±42.28）pg/mL，P <0.01。见图3。
　　2.3过表达 miR-146a 对 LPS刺激的NR8383细胞 IRAK-1和TRAF-6蛋白表达的影响
　　 与对照组比较，过表达miR-146a后，转染组IRAK-1 mRNA增加为（1.16± 0.1）倍，TRAF-6 mRNA增加为（1.19± 0.16）倍，差异均无统计学意义（P>0.05）;转染组IRAK-1 蛋白下降为（0.73±0.05）倍，TRAF-6 蛋白下降为（0.64±0.09）倍，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图4。
　　3讨论
　　 miR-146a 是第一个被发现能够调节免疫系统的微小RNA，当机体存在有感染、肿瘤时miR-146a 表达上调，上调人单核细胞白血病细胞（THP-1细胞）的 miR-146a 后将负性调控炎症因子的释放。研究证实在 LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中 miR-146a 表达上调;本研究发现过表达 miR-146a 后，用 L PS 刺激肺泡巨噬细胞， NF-κB 核移位受到抑制，TNF-α mRNA 表达下降，上清液中 TNF-α 蛋白含量也明显下降，提示 miR-146a 能够抑制 LPS 诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应。
　　笔者进一步实验发现，过表达 miR-146a 后，IRAK-1 mRNA 和 TRAF-6 mRNA 表达量无明显变化，而 IRAK-1 和 TRAF-6 蛋白表达下降。Taganov 等研究发现 LPS 刺激 THP-1 细胞后，miR-146a 表达上调，并通过突变试验和荧光素酶报道基因试验证实，miR-146a 的靶基因是 TLRs/NF-κB 通路中的两个接头蛋白编码基因 IRAK-1和TRAF-6。TLRs/NF-κB 是经典的炎症信号通路，当LPS 刺激肺泡巨噬细胞，可与细胞膜表面 TLR4 结合，导致 IRAK-1 自身磷酸化，继而活化 TRAF-6，使其与转化生长因子 β活化激酶1（TAKl）及 TAKl 的结合蛋白（TAB）形成复合物，导致 IκB 磷酸化和降解，最终使 NF-κB 移位进入核内，启动相关基因转录翻译生成 TNF-α 炎症因子。有研究表明过表达 IRAK-1 能够使 HEK293 细胞和 THP-1 细胞中NF-κB 呈剂量依赖性增加，同时 TNF-α 也增加，而敲除 IRAK-1 基因能降低 LPS 诱导的 THP-1 细胞炎症反应;同样过表达或者敲除 TRAF-6 也产生相同的作用。
　　参考文献
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