降浊颗粒对慢性肾衰竭大鼠肾组织纤维连接蛋白

[摘要] 目的 本研究拟通过动物实验，观察降浊颗粒对5/6肾切除慢性肾衰竭（CRF）大鼠肾组织纤维连接蛋白（FN）的影响，来探讨降浊颗粒对CRF的治疗效果及抗肾间质纤维化的机制。 方法 选择健康Wistar雄性大鼠120只，随机分为假手术组及模型组。5/6肾大部切除法建立CRF大鼠模型。模型组大鼠随机分为五组给药。动物灌胃给予生理盐水或给药，连续60 d。观察实验大鼠治疗前后的体征及一般状态，血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的变化，取大鼠肾脏病理切片，采用免疫组织化学染色（SP法）检测FN表达情况。 结果 降浊颗粒能够降低CRF大鼠血清BUN、Scr水平，贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组与模型对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05），高、中、低剂量组与贝那普利组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；降浊颗粒能够降低实验大鼠肾组织中的FN的表达，降浊颗粒高剂量组与模型对照组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），降浊颗粒高、中剂量组与贝那普利组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。 结论 降浊颗粒能够减少CRF大鼠血清BUN、Scr水平，抑制大鼠肾组织FN的表达，干预肾间质纤维化，最终延缓大鼠CRF进展，以降浊颗粒高、中剂量组效果最好，其疗效与贝那普利相当。
　　[关键词] 降浊颗粒；慢性肾衰竭；肾间质纤维化；纤维连接蛋白
　　[中图分类号] R692.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（a）-0018-03
　　慢性肾功能衰竭（CRF）是各种原发或继发性肾脏病终末期的共同表现，据国际肾脏病协会统计，本症自然人群发病率为98～198/百万人口，我国的统计资料显示尿毒症的年发病率为100～130/百万人口[1]，且有逐年增多的趋势。尽管分子生物学、免疫学飞速发展，对CRF的发病机制有了深入的认识，但是对于CRF的治疗，目前除替代疗法和肾脏移植，尚无其他满意的治疗方法。深入开展CRF的防治研究，延缓肾脏病的进展，减少CRF的发生具有重要的现实和经济意义。中医的辨证论治有着多靶点、综合治疗的效果，探讨中医药治疗CRF的有效药方已越来越受到重视。
　　“降浊颗粒”（由陈皮、茯苓、党参、半夏、生姜、大黄等组成）针对CRF患者胃肠机能紊乱这个环节而设，以健脾和胃、理气化湿、降浊止呕为主，经过长期临床验证降浊颗粒能明显改善CRF患者的胃肠道症状[2]，还发现该药对降低CRF患者血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）、血磷，升高血钙也起到了一定的作用。降浊颗粒在改善CRF患者的生存质量、延缓CRF进程、延缓透析时间、使患者带病延年等方面具有重要的现实意义[3-5]。本研究通过观察降浊颗粒对CRF大鼠肾组织纤维连接蛋白（fibronectin，FN）的影响，观察降浊颗粒对CRF的治疗作用及抗肾间质纤维化的机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验仪器
　　BM-IX生物组织包埋机（孝感市宏业医用仪器有限公司），台式干燥箱202-0型（北京市永光明医疗器械厂），LEICA RM2235切片机，CS-IV摊片烤片机（孝感市宏业医用仪器有限公司）。
　　1.2 实验动物
　　Wistar雄性大鼠120只，清洁级[动物合格证号：SCXK（川）2010-15]，体重（200±20） g，6～8周龄。
　　1.3 实验药物
　　降浊颗粒（15 g/袋；批号：20100501；云南理想药业有限公司生产），洛丁新（盐酸贝那普利；10 mg/片；国药准字H20030514；批号：008000；北京诺华制药有限公司），FN小鼠单克隆抗体[Abcam；FN（ab6328）]，超敏SP（鼠/兔）试剂盒（KIT-9730）（迈新生物技术公司）。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1 动物模型的制作 选择健康Wistar雄性大鼠120只，随机分为假手术组及模型组，5/6肾大部切除法（两期手术）建立CFR大鼠模型。
　　Ⅰ期手术：10%水合氯醛0.3 mL/100 g（体重）腹腔麻醉，背左侧12肋下脊柱旁竖切口，充分剥离左肾包膜，迅速切除上、下1/3肾组织，以明胶海绵压迫切面止血，然后分层缝合。术后10 d行Ⅱ期手术，同样的方法麻醉，右侧背部切开暴露右肾，结扎肾蒂，摘除右肾。假手术组与模型组同期行2次手术，但只打开腹腔，剥离肾包膜后缝合腹腔。全部动物自由摄取普通饲料和饮水。
　　Ⅱ期术后大鼠喂养7周后，随机抽出假手术组2只、模型组大鼠10只处死，取残余肾作病理HE染色，观察肾小球、肾小管、肾间质变化，见图1；所有大鼠尾部采血，测血BUN、Scr；确定CRF模型造模成功。造模期间大鼠死亡18只。
　　1.4.2 动物分组 模型组大鼠随机分为五组：模型对照组、贝那普利组、降浊颗粒高剂量治疗组、中剂量治疗组、低剂量治疗组，每组各15只；加假手术组（15只）共六组大鼠。
　　1.4.3 给药方法 降浊颗粒为临床经验方，60 kg人用剂量为45 g/d。大鼠给药剂量根据人与动物体表面积折算公式：理论上大鼠等效量=45 g×0.018×5=4.05 g，即理论上大鼠给予降浊颗粒有效剂量为4.05 g/（kg·d），降浊颗粒低剂量组为临床等效组，降浊颗粒中剂量组给药剂量为等效剂量的2倍，即8.1 g/（kg·d），降浊颗粒高剂量组给药剂量为等效剂量的4倍，即16.2 g/（kg·d）。
　　①假手术组（正常对照组）：予生理盐水2 mL/d灌胃；②模型对照组：予生理盐水2 mL/d灌胃；③贝那普利组：予2 mL/d（1.2 mg/d）贝那普利悬液灌胃；④降浊颗粒低剂量治疗组：予降浊颗粒4.0 g/（kg·d）灌胃；⑤降浊颗粒中剂量治疗组：予降浊颗粒8.1 g/（kg·d）灌胃；⑥降浊颗粒高剂量治疗组：予降浊颗粒16.2 g/（kg·d）灌胃。六组动物连续给药60 d，全部动物自由摄取普通饲料和饮水。

1.4.4 检测内容及方法 ①一般状态：精神状态、摄食、活动、体毛、尿量、体重及生存率；②血清Scr、BUN；③FN免疫组织化学染色（SP法）技术分析：采用免疫组化SP法检测肾小管-间质FN，第一抗体采用FN小鼠单克隆抗体，第二抗体采用超敏SP（鼠/兔）试剂盒，DAB显色。
　　1.5 结果判定
　　阳性：细胞胞浆或细胞膜出现棕黄色染色。按以下分析：①按平均灰度评分：平均灰度灰度数值从256到0，256到0代表从白到黑。平均灰度数值越小，表示染色越深，表达量越多。②按阳性细胞率评分：按染色阳性细胞占每个视野范围评分：3分：>相应视野50%；2分：占相应视野25%～50%；1分：<相应视野25%；0分：无。每张切片低倍镜下依序单盲观察5个视野，计算各项计分之和。
　　1.6 统计学方法
　　实验结果采用SPSS 13.0 for Windows统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 一般情况
　　造模后模型组大鼠与假手术组比较，进食量少，精神差，反应迟钝，活动减少，体重减轻，肢尾湿冷，鼠毛无光泽且有耸毛现象。贝那普利组和降浊颗粒各组经过治疗后，大鼠进食有所恢复，鼠毛较模型组润泽、光亮，活动有所增多，体重有所增加。
　　给药期间大鼠死亡情况：假手术组无死亡，贝那普利组死亡1只，模型对照组死亡3只，降浊颗粒低剂量组死亡2只，降浊颗粒中剂量组死亡2只，降浊颗粒高剂量组死亡1只。各组动物死亡率无明显差异。
　　2.2 血生化检查
　　经治疗后，贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组血清BUN、Scr水平明显低于模型对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），降浊颗粒高、中、低剂量组与贝那普利组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
　　2.3 降浊颗粒对5/6肾切除大鼠FN阳性细胞率及平均灰度的影响
　　经治疗后，贝那普利组，降浊颗粒高、中、低剂量组FN阳性细胞率低于模型对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；降浊颗粒高、中剂量组，贝那普利组FN平均灰度较模型对照组增高，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。降浊颗粒高、中剂量组FN表达与贝那普利组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1、图2。
　　3 讨论
　　肾间质纤维化是各种原因所致的肾脏疾病慢性进展，最终导致肾功能衰竭的共同机制，而细胞外基质（ECM）的过度积聚是导致肾纤维化的最主要因素之一。研究证实，ECM合成和降解失衡是ECM聚集及肾小球功能损伤的主要原因[6]。ECM主要是由LN、FN、Col Ⅲ等成分组成。
　　FN是细胞外基质中一类重要的糖蛋白，主要位于小管间质区，彼此以纤维结构相连，对肾小管正常结构起着重要作用，正常情况下，FN在肾脏表达不明显，在肾间质病变时表达增强，进一步的研究又发现其变化与总的细胞外基质的变化趋势相一致，在炎症条件下，对介导细胞增殖和其他细胞外基质成分的沉积具有重要意义[7]。
　　在本研究中，模型对照组与假手术组比较FN表达增加，符合慢性肾衰竭病理改变。经治疗后，贝那普利组、降浊颗粒高、中、低剂量组FN阳性细胞率低于模型对照组，降浊颗粒高、中剂量组和贝那普利组FN平均灰度较模型对照组增高；降浊颗粒高、中剂量组降低FN表达疗效与贝那普利组相当。说明降浊颗粒能减少CRF大鼠肾组织FN的表达，干预肾间质纤维化，延缓大鼠CRF进展，尤其以高、中剂量组疗效最佳，其疗效与贝那普利相当。
　　[参考文献]
　　[1] 陈灏珠.实用内科学[M].12版.北京：人民卫生出版社，2005：2078-2094.
　　[2] 吉勤，李桢，吴净，等.降浊止呕颗粒对慢性肾衰竭胃肠机能调节的临床观察[J].中国中西医结合肾病杂志，2004，5（5）：287.
　　[3] 吉勤，杨蕊娇，吴净，等.降浊止呕颗粒对延缓慢性肾衰竭进展的临床研究[J].云南中医学院学报，2007，30（4）：38-41.
　　[4] 刘培允.益肾降浊方灌肠治疗慢性肾衰竭的临床观察[J].中国医药导报，2008，5（24）：101.
　　[5] 熊有明，谢正兰.慢性肾衰竭的中医药治疗进展[J].医学综述，2009，15（20）：3155-3157.
　　[6] 赵慧颖，黄雯，黄海长，等.基质金属蛋白酶在大鼠肾小球硬化中的表达[J].中国血液净化，2008，7（11）：610-614.
　　. Nephrol，2002，15（6）：633-642.