皮肤美白化合物的筛选评价新进展

　　皮肤白皙一直是亚洲女性追求的美容目标之-，也是亚洲女性美容的首要难题。现今市场上已经开发出许多皮肤美白产品，并且发展迅速，如早期的氢醌、中期的果酸及组织提取物胎盘膏，以及近期的熊果苷、维生素C(Vc)衍生物及甘草提取物等。人体皮肤的颜色取决于皮肤中黑色素的含量与分布，而黑素细胞的结构、功能和数量是产生黑色素的决定因素，直接影响皮肤中黑色素的含量。在黑素细胞中，黑色素是由酿氨酸转化而来，其中酿氨酸酶是黑色素合成的主要限制酶，因此酿氨酸酶抑制剂是使得黑色素减少的经典皮肤美白剂。

　　1美白化合物的分类

　　1.1氢醌氢醌是最常用的处方美白药物，存在不稳定性和副作用。这种羟苯基化合物最初被认为是通过抑制酿氨酸酶发挥作用的，因为它的结构和酿氨酸酶作用底物相似。一种可能的机制是能够抑制黑素细胞DNA和RNA的合成，使黑色素降解，破坏黑素细胞。另一个可能的机制是对黑素细胞的细胞毒作用，进入到黑素细胞的黑素小体，阻断黑色素生成途径的一个或多个步骤，同时氢醌在酿氨酸酶作用下被氧化生成有毒性的半醌游离基（semi-quinoneradicals)，后者使细胞膜脂质发生过氧化，破坏细胞膜性结构，最终导致细胞死亡。氢醌的药效与药物浓度、载体性质和制剂的稳定性有关，其对酿氨酸酶活性的影响呈双向作用，即低浓度（0.1?0.5pmol/L)时下调酶活性，高浓度（1?10^mol/L)时则能轻度上调酶活性。由5%的氢醌、0.1%的维甲酸和0.1%的地塞米松混合制成一种经典的复合制剂，维甲酸的作用是避免氢醌被氧化，提高角质层渗透性，使黑色素淡化和促进角质层细胞增殖。皮质类固醇能够减少氢醌的刺激作用，还能通过减少细胞代谢来抑制黑色素的生成。该制剂治疗表皮色素沉着的疗效已得到验证，但是对炎症后真皮层的色素沉着没有显著作用。

    1.2氢醌衍生物对苄氧酚是氢醌衍生物之一，在经过酿氨酸酶代谢后具有永久破坏黑素细胞的高活性，使用时会有灼烧感，但是并没有限制它的使用。它对于某些病人而言是强烈的致敏物质，会引发星星点点的黑白斑，这可以用于治疗白斑病中还没有被白化的部分。对甲氧酚是氢醌的另一种衍生物，在黑素细胞中被酶氧化后产生具有高细胞毒性的化合物，例如醌，这种物质能够破坏黑素细胞从而使得皮肤色素淡化，它和维甲酸在治疗色素沉着方面有协调作用。

　　1.3对苯二酚对苯二酚是一种传统的、但十分快速的皮肤美白剂，其作用是通过凝结酿氨酸酶中的氨基酸，使酶失去活性，从而阻止皮肤黑色素的生成。目前，各国对其安全性用量规定各异，主要是其腐蚀性、细胞毒性和过敏性反应。根据相关研究，对苯二酚在浓度为0.8%时，对酿氨酸酶的抑制率就达到93.4%，当浓度为1.5%时，抑制率几乎达到100%，说明对苯二酚的美白效果显著，但因其安全性的问题，目前已很少使用。

　　1.4熊果苷和芦荟苦素熊果苷为白色粉末，易溶于水，是对苯二酚衍生的苷类，其水解产物对苯二酚和葡萄糖主要通过对黑素细胞的细胞毒性作用和对酿氨酸酶的阻碍机制，有效地抑制黑色素的生成，是国际公认的高效美白剂，可消退老年黄褐斑，对雀斑也有效，可显著消退由于紫外线引起的色素沉着[2]。熊果苷还克服了对苯二酚的不稳定、不安全性，是美白化妆品的常用成分。熊果苷可能抑制黑素细胞基因转录后水平，因为酿氨酸酶相关蛋白（tyrosinaserelatedprotein，TTRP)、酿氨酸相关蛋白-1(TTRP-1)及酿氨酸相关蛋白-2(TRP-2)的含量没有改变，而活性降低。

　　芦荟苦素通过两种机制抑制酿氨酸酶的活性，一是通过竞争性抑制多巴氧化位点从而抑制多巴醌的形成，二是竞争性抑制羟化酶位点上的铜离子，达到非竞争性抑制酿氨酸羟化酶活性的作用。因此芦荟苦素对酿氨酸酶活性是混合性抑制，通过两种机制完成。芦荟苦素在较低浓度时对黑色素细胞酿氨酸酶活性有明显的抑制作用，可抑制黑色素生成，并且细胞毒性较低。杨壮群等[8]研究发现，芦荟苦素与熊果苷的混合物对体外培养的黑素细胞的酿氨酸酶活性及黑色素生成有显著抑制作用，并较单一药物作用增强。

　　1.5维甲酸维甲酸抑制黑色素生成的作用较弱，对黑素细胞生成黑色素没有直接的抑制作用，对黑素细胞和角质细胞之间的相互作用也没有影响。维甲酸的美白作用是使黑色素分散到角质细胞中，并能加速表皮更新，但它对用药部位具有刺激性。维甲酸对炎症后的色素沉着的作用也不明显。维甲酸能够加强氢醌和氢醌衍生物的美白作用，这是一种特殊的机制。实际上，维甲酸是一种强效的谷胱甘肽酶抑制剂，能够显著减少人体中谷胱甘肽基因的转录，从而抑制该酶的表达。

　　1.6曲酸曲酸的美白机制是与酿氨酸酶中的铜离子鳌合，进而使缺少铜离子的酿氨酸酶失去活性，以达到美白效果。曲酸同时具有抑制二羟吲哚(DHI)聚合和抑制二羟基吲哚羧酸（DHICA)氧化活性的作用。但由于曲酸不稳定，对光、热较敏感且易与金属离子（如Fe3+)鳌合，易氧化、变色，因而有不少曲酸衍生物（如曲酸棕榈酸醋）用于代替曲酸美白祛斑，克服了曲酸的不稳定性质，并显示出较强的氧化效果和很好的安全性。

　　1.7维生素C磷酸酯镁Vc主要通过抑制酿氨酸酶活性、使氧化性黑色素还原为无色的还原性黑色素，并阻断黑色素生成的氧化反应链而起到美白、祛斑作用。但Vc存在水溶性强，皮肤吸收性差，在空气中极不稳定，易氧化变色的问题。其衍生物Vc磷酸酯镁(VcrPMG)克服了Vc的上述缺点，经皮肤吸收后可在体内分解释放出Vc，同时也提高了皮肤的吸收率，大大提高了Vc的疗效。近年来VcrPMG作为美白抗衰老成分，正引起化妆品设计师的重视。

　　2美白化合物的筛选

　　2.1酶测定和细胞的培养方法酿氨酸酶抑制剂的体外测定方法是对美白产品是否有酿氨酸酶活性抑制作用的基本判断步骤。若实验测定采用的是纯化晡乳动物的左旋酿氨酸酶或是重组酶，加入协同底物左旋多巴，则这种测定方法更具有相关性。可以根据在475nm的波长下测定的多巴色素的吸光度，从而对酿氨酸酶活性进行定量，也可以采用其他细胞自由酶的测定方法，例如TRP-2和TRP-1的活性检测。对新化合物的进一步筛选可以用培育的黑素细胞完成，无限繁殖的杂交鼠-黑素瘤细胞是合适的模型，而正常的人体黑素细胞是更好的模型。相关的评价参数主要有：黑素细胞的增殖抑制作用、黑素的含量和黑素的合成。将待测的美白化合物在黑色素生成之前加到培养基，可评价该化合物对黑色素合成的抑制作用；在产生大量黑色素后加入该化合物，则是评价该化合物的加速黑色素沉着或消退作用。在角朊细胞存在时更容易生成黑色素，因此经常采用角朊细胞和黑素细胞共培育的方法。例如，在有黑素细胞和角朊细胞的共同培养基中加入美白化合物，合成的黑色素可以用乙氨基乙基醋酸纤维素膜过滤进行生物检测。

　　2.2重建人体表皮重建人体表皮是评价色素改善作用更精确的模型，通过共培育人体黑素细胞和角朊细胞实现。利用酶将表皮和真皮分离，并用特定的选择性培养基，获得高纯度的黑素细胞，把黑素细胞和角朊细胞一起种植在表皮和真皮层间，生成多层的、具有黑色素沉着的表皮层，以此来表达供体的皮肤表型。

　　2.3动物模型目前用于测定黑色素淡化作用的动物模型还存在不足，因为啮齿目动物的皮肤和毛发生长特点是不同于人体皮肤的，特别是表皮的黑色素形成可能不同。一般是采用黄棕色豚鼠，黄棕色豚鼠的皮肤黑素细胞和黑素小体的分布近似于人类，试验结果重复性好，较小鼠模型更适用于研究化妆品的美白功能。

　　3美白化合物的效能评价

　　3.1仪器评价客观的仪器测定方法用于美白产品的效能评估曰益受到推广，尤其是对于那些缓慢发挥药效的产品。生物工程技术和仪器测量方法在这方面发挥了很大作用，并且近几年发展迅速。

　　三色比色法可以很好地测试皮肤的色泽强度变化。CIE机构在1976年建立了CIELAB颜色空间系统，在皮肤病学和整容学测定皮肤颜色变化中得到广泛的运用。在这个系统中的三个量纲代表了比色法中的三个参数，一个参数是发光强度L*，用于评估皮肤的黑白程度；另外两个参数是色度a*和b*，分别代表色调和彩度。分光光度法是对皮肤的两个生色团（黑色素和血红蛋白）特有的波长吸收的测定，黑色素的指标M与皮肤的黑化程度相关，红斑指数E与血红蛋白的含量相关。从这两种色彩评估方法中可以看出，发光强度L*和M指数分别能够对美白产品的效能进行评价。

　　3.2临床评估目前常采用对人体志愿者进行紫外线照射后使用美白化合物的试验，通过仪器定量测定，评价美白组分对光诱导产生色素的抑制和淡化作用。为了避免色素损伤，临床试验需要持续几个月，一般试验产品是一天使用两次，持续两个月，期间要保证实验组和对照组的皮肤安全。研究参数包括色素斑点的数量，皮肤的颜色及色泽程度。也可以采用等级量表和临床评分的方法，但评估者的主观因素可能影响到测试结果。以上这些测试方法适用于有大量受试者的临床试验。

　　3.3可视的测定方法图像记录方法能够有助于客观地评价美白产品对色素斑点的活性作用。可控的紫外摄影图像能够比可见光影像提供更多的信息，波长为365nm的紫外光在穿透表皮时能被黑色素吸收，从而减弱光强度，在真皮层中的胶原束也能吸收该紫外光并能反射紫外光，被反射的紫外光再次穿透表皮被黑色素再一次吸收。由于黑色素对紫外光的吸收强于可见光，因此紫外光检测可以提高正常皮肤与色素斑点之间的对比度。VC98型号的紫外照相机要求直接接触皮肤使用，以避免环境光的影响。这种可加强可视效果的紫外光检测方法(ULEV)能够记录表皮中累积的黑色素量，并进行图像分析，但ULEV法对于黑色素含量多的皮肤识别效果差。

　　3.4Corneomelametry法把受试者的角质层用透明胶带从皮肤表层剥离，采用Corneomelametry法测定角质层细胞中的黑色素含量，即将样品Fotana-Masson银染色后，在显微镜下用光密度测定法测定光透过量，从而计算黑色素的含量。

　　3.5适用性测试当产品被证明有所需要的功能时，就需要在大范围内对受试者的使用情况进行评定。受试人群应该经过仔细选择，特别是年龄、性别、阳光接触情况，还有自身的色素沉着特性。专家和受试者对产品的效能和耐受性意见都具有参考价值。在小组试验中，受试者个体差异的存在是不可避免的，所以美白产品的效用评估就需要大量的测试数据才具有意义。

　　4小结

　　亚洲人最崇尚肌肤美白，美白产品在化妆品领域中占据重要位置，因而美白产品的研究保持着日益增长的趋势。美白产品的发展趋向于高效、稳定、安全的新型美白剂，动植物美白成分提取物会越来越多地用于美白产品，以提高美白化妆品的安全性、温和度和美白效果。相信随着科技的不断进步和对美白产品的急切需求，新的美白化合物和新剂型如脂质体包裏美白剂，它可以提高美白成分的透皮性和稳定性；微乳化技术以及新的透皮技术的应用，将会提高美白物质的渗透性，增强美白功效；此外微胶嚢技术也用于保护不稳定美白成分。