胃癌中微淋巴管密度检测的意义

【摘要】 目的 利用淋巴管内皮生长因子受体3(vegfr3)检测胃癌组织内微淋巴管密度(mld)，研究其与增殖期细胞核抗原(pcna) 及临床因素之间的相关性。方法 采用免疫组化法，以vegfr3 (又称flt4) 为标记物，检测60例胃癌淋巴结转移组织内mld与增殖期细胞核抗原(pcna) 蛋白及临床病理因素之间的相关性。结果 胃癌淋巴结转移组织vegfr3阳性率和mld明显增高;胃癌组织中mld与pcna之间呈正相关。结论 vegfr3可促进肿瘤微淋巴管生成,vegfr3和mld的表达可能与胃癌的淋巴结转移相关。

【关键词】 胃癌;淋巴管内皮生长因子受体3;微淋巴密度

　　abstract：objective to detect the lymphatic microvessel density(mld) in gastric cancer by lymphatic endothelial growth factor receptor3(vegfr3) and to study the correlation between the proliferating cell nuclear antigen(pcna) protein and clinicopathological s vegfr3 was used as a marker to detect the expression of mld and pcna protein in 60 cases of gastric cancer tissues by immunohistochemical s the positive rate of vegfr3 and mld were significantly increased in gastric cancer with lymph node metastasis,and there was a positive correlation and pcna in gastric sion vegfr3 might promote microtumor lymphangiogenesis,and vegfr3 and the expression of mld may be related to lymph node metastasis of gastric cancer.

　　key words：gastric cancer;lymphatic endothelial growth factor receptor 3;lymphatic microvessel density

　　肿瘤的侵袭和转移是患者死亡的重要原因之一。胃癌早期以淋巴转移为主，晚期才发生血行转移。尽管淋巴管在胃癌转移中的作用非常明确，但因长期未发现明确的淋巴管内皮标记物和淋巴管生成因子，使人们对胃癌淋巴管生成(lymphangiogenesis)的研究相对滞后于胃癌血管生成(angiogenesis)。淋巴管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor3，vegfr3)是vegf基因家族成员vegfc的受体，主要在淋巴管内皮细胞和单核细胞系造血细胞中表达。因此，vegfr3可作为淋巴管内皮细胞的标记物，以区别于血管内皮细胞[1,2]。本实验采用免疫组化法和图片分析法，检测胃癌组织中vegfr3和微淋巴管密度(microlymphatic density，mld)的表达并探讨其与增殖期细胞核抗原( proliferating cell nuclear antigen，pcna)及临床病理因素之间的相关性。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　选择1999～2002年在咸宁学院附属第一医院手术切除的胃癌标本共60例，并取距离癌组织>5cm的正常组织作对照。患者中男48例，女12例，年龄32～76岁，平均58岁。标本均经10%的中性福尔马林固定，常规石蜡包埋。

　　1.2 实验试剂与材料

　　兔抗人vegfr3多克隆抗体、小鼠抗人pcna单克隆抗体、即用型链酶亲合素生物素过氧化物酶复合物试剂盒。试剂盒组成(福州迈新公司)：a：内源性过氧化酶阻断剂(无色)，b：动物非免疫血清(羊，蓝色)，c：生物素标记的羊抗鼠/兔igg(黄色)，d：链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶(红色)。试剂盒不含酶底物显色剂及复染剂。

　　1.3 方法

　　按试剂盒说明书方法操作。

　　1.4 结果判断

　　vegfr3蛋白主要表达于胃癌细胞及正常胃黏膜上皮细胞的胞质和(或)细胞膜上。测微淋巴管密度(mld) ,先在低倍镜(sp×200) 视野下观察，选择vegfr3 阳性细胞最多的3个视野, 然后分别在高倍镜(sp×400) 视野下计数。染色的单个游离内皮细胞(排除肿瘤细胞或其他基质细胞)计为1条微淋巴管，成簇状相连或形成管状结构的细胞团计为1条微淋巴管，有血管平滑肌的管状结构不计入内。取其中计数最多的1个高倍镜视野内的微淋巴管数作为该组织的mld。

　　pcna 采用免疫反应半定量评分[3]。按染色强度评分: 0分为无染色,1分为染色较弱(浅黄色) , 2分为中等强度染色(棕黄色) , 3分为强染色(棕褐色)。按染色细胞的百分比评分:0分为无阳性细胞,1分为染色细胞<10%, 2分为染色细胞在11%～50%之间, 3分为染色细胞在51%～80%之间, 4分为染色细胞>80%。两种评分相乘即得出免疫反应评分, 范围在0～12分之间。

　　1.5 统计学处理

　　对mld、pcna行kolmogorovsmirnov z检验。不符合正态分布，故用中位数(四分位间距)表示，采用mannwhitney u检验;相关性检验采用spearman等级相关及单因素logistic回归分析，给出or 值( 95%可信区间)。所有统计采用spss10.0软件进行计算。

　　2 结 果

　　2.1 胃癌和正常组织中mld检测

　　通过免疫组化法染色,检测到胃癌和胃正常组织中mld分别为6(4.00～8.00)和3(2.00～5.75)，胃癌组织中mld明显增高(u=201.5，p=0.01)。(图1，2)图1 胃癌中mld的阳性表达 (sp×200)图2 胃癌中vegfr3的阳性表达 (sp×400)

　　2.2 胃癌组织中mld 与pcna 之间的相关性mld 与pcna之间有相关性(r=0.26，p<0.05)。

　　2.3 胃癌组织中mld与临床病理因素之间的相关性

　　胃癌组织中mld与患者淋巴结转移状况有相关性(r=0.33,p<0.05), 与其他临床病理因素之间无相关性,见表1。表1 胃癌组织中mld 与临床病理因素之间的相关性

　　2.4 胃癌组织中mld 对淋巴结转移影响的单因素logistic 回归分析

　　按中位数将mld 分成高低两组，行单因素logistic 回归分析显示mld 对淋巴结转移有影响，高mld组发生淋巴结转移的风险是低mld 组的3.51倍( 95%可信区间为1.20～10.24，p= 0.02)。

　　3 讨 论

　　近来研究表明，癌细胞可以诱导肿瘤内淋巴管生成，并通过侵入淋巴管而发生区域淋巴结转移[4]。区域淋巴结转移是胃癌患者重要的预后因素，也是临床上选择术后辅助化疗或放疗的重要标准。vegfr3是vegf基因家族成员vegfc 的受体,作为vegfc 的受体, vegfr3主要在淋巴管内皮细胞和单核细胞系造血细胞中表达, 因此可作为淋巴管内皮细胞的标记物, 以区别于血管内皮细胞[1，2]。多数学者研究认为, mld与胃癌区域淋巴结转移有相关性[5，6]，可能是因为mld 高则癌细胞更易侵犯淋巴管[6]。但有少数学者研究认为mld与区域淋巴结转移无相关性[7，8]。至于mld 是否与胃癌患者预后有关，研究报道不多，结果也不一致[5, 6]。本研究以vegfr3 抗体为标记物检测发现，胃癌组织中mld明显高于正常组织，癌组织中mld与淋巴结转移状况有相关性，高mld 组发生淋巴结转移的风险是低mld组的3.5倍。因尚未取得完整的随访资料，无法判断mld的预后价值，有待今后进一步研究。另外，本研究发现胃癌组织中mld与pcna 之间呈正相关，提示胃癌淋巴管生成活性强则胃癌细胞的增殖活性也较强。

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