细菌在黄土上的吸附/解吸特征及吸附量对土壤石

　近年来，石油污染已成为人们所面临的严重环境问题之一。石油在勘探、开采、运输、存储以及销售过程中，都有可能引起对土壤不同程度的污染，而在油田及贮油场所尤为严重。微生物对石油污染土壤的修复技术以其操作简单，费用低，无二次污染备受欢迎[1]。微生物除油效果的好坏可能与其在土壤表面的吸附量有直接关系。首先我们通过测定不同浓度微生物在黄土上的吸附量，
　　求出等温吸附方程，再次对微生物在黄土上的解吸特性进行试验，最后研究微生物吸附量对土壤石油降解的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 细菌
　　试验所用的微生物细菌D是由从延安炼油厂的污水处理厂中采集的活性污泥，经分离、纯化筛选出的优势降解菌。主要根据菌的生长状况和降解能力进行筛选。
　　1.2 培养基
　　试验所用的富集培养基是牛肉膏蛋白胨培养基[2]，其配方如表1所示。试验所用的扩大培养基是无机盐培养基，培养基的组成：柠檬酸钠 5g/l，KNO3 2 g/ L，K2HPO4 1 g/ L，KH2PO4 1 g/ L，MgSO4·7H2O 0.2g/l，pH调到7.5，每升培养基中加2ml微量元素混合液，其组成为：EDTA 50g/l，ZnSO4 2. 2g/ L，CaCl2 5. 5 g/ L，MnCl2·4H2O 5.06g/l，FeSO4·7H2O5g/l，（NH4）6Mo7O24·4H2O1.1g/l，CuSO4·5H2O 1.57g/ L，pH调节到7.0[2]。表1 富集培养基配方牛肉膏蛋白胨NaCl水pH3g10g5g1000ml7.0-7.2
　　1.3 黄土
　　试验所用黄土采自陕北靖边县，未受污染。挖取0-20cm的表层鲜土，去杂、粉碎、过筛、混匀，密封避光储存在塑料袋内备用。
　　1.4 油土
　　称100g上述干燥黄土倒入烧杯中，准确称取5g原油，用30mlCCl4溶解后倒入黄土中混匀。在通风条件下风干3d，待CCl4完全挥发后储存在冰箱中备用。
　　1.5 试验方法
　　1.5.1 细菌浓度标准曲线的制作
　将细菌D接种到富集培养基中，在水浴振荡摇床上（温度37℃，振荡频率120r/min）培养48h后，移取若干毫升菌液到扩大培养基中继续培养60h。用血细胞计数板计数，并在10支无菌试管中分别用无机培养基将菌液浓度稀释调整为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10×107个/ml。在500nm下用紫外分光光度计分别测定其OD值。浓度-吸光度标准曲线见图1。图1 标准曲线
　　1.5.2 细菌吸附量测定方法
　　取7支已消毒的20ml塑料离心管并编号，于每支管中准确称取黄土0.3g。将经过48h富集培养，60h扩大培养的菌液测定吸光度，计算出浓度后，稀释为5、10、15、20、25、30、35×107个/ml。对于每个浓度，量取10ml菌液加入到对应的装有黄土的离心管中，振荡吸附15min，离心10min，转速1000rpm。取上层清液测定吸光度，计算出菌液浓度。则单位质量黄土表面的吸附量计算公式为：Г=（C1-C2）×V/m
　　其中：C1 ，C2-吸附前后菌液浓度
　　V-菌液体积
　　m-黄土的质量
　　1.5.3 细菌解吸量测定方法
　　经上述吸附操作的土样离心后，倾去上清液。加入10ml无机培养基，密封后置于摇床振荡15min，离心10min，转速1000rpm。取上清液用紫外分光光度计测定吸光度。
　　1.5.4 吸附量对石油降解影响的测试方法
　　取6个锥形瓶并进行编号。于每个瓶中准确称取10g油土。测定并计算经过2天富集培
　　养，2天扩大培养的菌液的浓度，并将其稀释为5个不同浓度。各浓度对应的吸附量可将其代入到等温吸附方程中求解。将不同浓度菌液分别移取6ml加到对应编号的锥形瓶中，振荡使得菌液与油土充分混匀。剩余一个锥形瓶中不加任何菌液作为对照。用6层纱布封口，其一用来防止外来微生物污染，其二保证瓶内有充分的氧气。将6个锥形瓶在水浴锅中放置30d（温度37℃），最后用重量法测定各自含油量。
　　2 试验结果与讨论
　　2.1 细菌D的等温吸附方程
　　相同体积的菌液，若浓度不同，则其在黄土上的吸附量不同，等温吸附曲线见图2，由图可见，当菌液浓度较低时，吸附量随浓度增加而急剧上升，随着菌液浓度进一步增加，吸附量随浓度的增加渐渐平缓。土壤对D菌的吸附涉及物理吸附和化学吸附，细菌D可通过范德华力等分子间作用力与土壤 中有机质或无机胶体表面吸附位点发生作用，也可通过细菌D的功能基团与土壤中的有机或无机物质形成络合物或螯合物，被吸持在土壤中[3][4] [5]。在菌液浓度较低时，黄土表面只有部分被D菌占据，随着浓度增大，黄土表面被D菌占据的面积也增大，当浓度达到一定程度，黄土表面的特异吸附点基本饱和，无法再接受D菌，故吸附量不再增加[6]。
　　由计算得，细菌的解吸量平均仅是吸附量的1%。虽然解吸量随吸附量的增加而增加，但从黄土中解吸的细菌D非常少。表明细菌D在黄土上的解吸作用极弱，吸附固定作用较强，一旦被吸附后，较难被解吸。
　　2.3 吸附量对土壤中石油降解率的影响
　　由于原油的挥发作用，最后用重量法测得未加菌液的油土的含油量为3.52%。细菌D在黄土上的吸附量不同，对石油的去除效果也会产生差异。由表3可以看出，细菌在黄土上的吸附量越大，降解的油量也越大。说明在用微生物修复油污土壤时，微生物在土上的吸附量是一个至关重要的因素，也反映出在修复油污土壤时，起作用的微生物主要是固着在土壤上的微生物。当土中含油量为3.52%，菌液浓度为1.0×108个/ml，经过30d后，降解率可达到45%。表3 吸附量与降解率的关系
　　3 小结
　　⑴当菌液浓度较低时，吸附量随浓度增加而急剧上升，随着菌液浓度进一步增加，吸附量随浓度的增加渐渐平缓。细菌D的等温吸附方程为：
　　Γ=C菌0.1153-2.445×10-10C菌
　　⑵细菌在黄土上的解吸作用极弱，解吸量平均仅是吸附量的1%，吸附固定作用较强，一旦被吸附后，较难被解吸。
　　⑶随着细菌在土壤上吸附量的增加，降解率也相应提高。当土中含油量为3.52%，菌液浓度为1.0×108个/ml，经过30d后，降解率可达到45%。
　　参考文献
　　[1] 郭超，黄延林，唐智新等.西北黄土地区现场石油污染土壤生物修复研究[J].环境污染与防治，2011，33（10）：5-8.
　　[2] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].第3版.北京：高等教育出版社，1999.
　　[3] 范成新.细菌在土壤上吸附的研究--以一株假单胞菌（Pseudomonas Spo）为例[J].土壤，1992（01）：23-28.
　　[4] 肖衍繁，李文斌.物理化学[M].2版.天津：天津大学出版社，2004：342-348.
　　[5] 赵景联.环境生物化学[M].北京：化学工业出版社，2007.