应用组织芯片技术研究结直肠癌中Lumican的表达及

【摘要】 ［目的］ 探讨lumican的表达与结直肠癌发生、发展的关系。［方法］ 构建100对结直肠癌及相应癌旁正常黏膜上皮组织的组织芯片，应用免疫组化方法检测lumican的表达强度。［结果］ lumican在结直肠癌组织中的表达率（84.0％）显著高于癌旁正常黏膜中的表达率（42.6％）（p<0.01）。lumican在腺癌中的表达率（87.2％）高于在黏液腺癌及印戒细胞癌中的表达率（68.8％）(p<0.05)。lumican的表达强度与结直肠癌浸润深度之间存在非常显著的正相关（r=0.07959，p<0.01）及线性关系(χ2=5.2148，p<0.05)，即随着浸润程度加深，lumican的表达强度逐渐增加。lumican的表达强度与患者的年龄、性别、发病部位、淋巴结是否转移及分化程度无关（p>0.05）。［结论］ lumican的异常表达可能是结直肠癌发生的早期事件，与结直肠癌的组织分型和侵袭能力有关，在结直肠癌的发生发展中发挥重要作用。

【关键词】 肠肿瘤

application of tissue chip assay to expression of lumican for colorectal cancer and its significance

song hong-jiang1, tong dan-dan2, jin yin-ji2, et al.

( affiliated hospital(cancer hospital) of harbin medical university，harbin 150081，china;

2. department of pathology, the medicine college of harbin medical university, harbin 150081, china)

abstract: ［purpose］to explore the relationship of lumican expression with carcinogenesis and progression in colorectal cancer. ［methods］ one hundred couples of tissue chips of colorectal cancer tissues and adjacent normal epithelium mucosa tissues were constructed. expression intensity of lumincan was measured by immunohistochemical method. ［results］ lumican expression ratio in colorectal cancer tissues (84.0%) was significantly higher than that (42.6%) in adjacent normal epithelium mucosa tissues (p<0.01). lumican expression ratio in adenocarcinoma (87.2%) was higher than that in mucinous adenocarcinoma and signet-ring cell carcinoma (68.8%), (p<0.05). there was a distinctly positive correlation between intensity of lumican expression and invasive depth in colorectal cancer (r=0.07959,p<0.01), as well as linear correlation (χ2=5.2148，p<0.05). lumican expression intensity increased as invasive depth increased in colorectal cancer. lumican expression intensity didn’t relate to age, sex, tumor location, lymph node metastasis and cell differentiation (p>0.05). ［conclusion］ mal-expression of lumican correlates to histopathologic type and invasive capability in colorectal cancer. it may be the early event of colorectal carcinogenesis.

key words: colorectal neoplasms; lumican; tissue chip

蛋白聚糖作为细胞外基质的重要组成部分能够调节癌细胞的生长和侵袭，在原发灶的生长或转移灶的形成期间，细胞外基质会通过生物合成和降解形成特征性的重塑[1~3]。小的富含亮氨酸蛋白聚糖（slrp）不仅可以调节细胞外水平衡、影响组织生物力学，同时在细胞迁移、增殖、肿瘤生长、黏附和移行，以及调节生长因子的活性等方面也发挥着重要作用[4~6]。lumican作为slrp家族成员之一，是近几年发现的与结直肠癌发生发展密切相关的基因。本研究应用组织芯片技术及免疫组化方法检测分析，旨在探讨lumican在结直肠癌组织中的表达及其与组织学及临床病理学之间的关系。

1 材料与方法

1.1 临床病理资料

收集2003年6~12月哈尔滨医科大学附属肿瘤医院腹外科结直肠癌手术切除标本(结直肠癌组织和癌旁正常黏膜上皮组织)100对。病理分型：中分化腺癌62例，低分化腺癌21例，黏液腺癌及印戒细胞癌17例。淋巴结转移阳性36例，阴性64例。因芯片脱落及残缺无法分析的点共6对。

1.2 构建组织芯片及免疫组化染色方法

1.2.1 主要试剂

sp-9003免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术公司。黏片剂apes和dab显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司。羊抗人lumican多克隆抗体购自r＆d systems公司。

1.2.2 组织芯片构建

采用组织芯片制作仪（microarrayer，beecherinstruments，usa），每例分别穿取结直肠原发灶癌组织和远癌正常结直肠黏膜组织，制作结直肠癌及其癌前病变的组织微阵列蜡块，行4μm连续切片，40℃裱片（载玻片经0.1%多聚赖氨酸防脱片处理），56℃烤片3h后移至37℃恒温箱中过夜，常温保存备用。

1.2.3 免疫组化

免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白—过氧化物酶法（streptavidin-proxidase method，s-p法）。脱蜡水化，采用微波煮沸修复抗原,山羊血清封闭， lumican一抗工作浓度为1∶50，一抗4℃孵育过夜，pbs洗3次，二抗室温孵育20min，滴加辣根过氧化物酶（hrp），室温作用20min，pbs洗3次后dab 显色5～10min，pbs冲洗,苏木精复染2min，盐酸酒精分化，常规脱水、透明、中性树胶封片。采用pbs 代替一抗做空白对照。

1.3 免疫组化染色结果判定

每张切片在高倍镜(×400)下观察5个不同视野内细胞蛋白染色情况。lumican蛋白阳性反应颗粒定位于细胞膜和细胞浆内。lumican阳性结果判定：凡在细胞浆内及胞膜上着色呈浅黄或棕黄色颗粒，51%～75%染色棕黄为（+++），26%～50%染色黄色为（++），10%~25%染色浅黄为（+）；细胞浆或胞膜无着色为阴性（-）。

1.4 统计学分析

使用的统计方法包括wilcoxon秩和检验、r检验（典型相关分析）及χ2检验（线性趋势检验）。p<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 组织芯片免疫组化的有效性

5个阵列蜡块（共200个点）切片经he染色及免疫组化观察，结直肠癌及其癌旁正常黏膜组织芯片蜡块组织阵列排列整齐，组织形态良好。残缺点数共8个，可供分析的成对点共94对，免疫组化有效信息量94％。

2.2 lumican在组织芯片中的表达

在94对结直肠癌及癌旁正常黏膜组织芯片中，79例癌细胞中有lumican蛋白不同程度的表达（见图1），而癌旁正常黏膜上皮组织中仅40例有lumican蛋白的弱表达（见图2），lumican在结直肠癌组织中的表达显著高于在癌旁正常黏膜组织中的表达(p<0.01)（见表1）。

2.3 结直肠癌中lumican表达与临床病理参数的关系

lumican的表达强度与浸润深度之间存在着显著正相关(r=0.07959，p=0.0078)及线性关系(χ2=5.2148，p=0.0224)，即由肌层到浆膜外，lumican的表达增强。lumican的表达强度在不同的组织分型中存在差异（p=0.0314），即在腺癌中lumican的表达强度高于在黏液腺癌及印戒细胞癌中的表达（见图1~4）。

3 讨 论

lumican基因定位于12号染色体的12q21.3~q22区。lumican蛋白由338个氨基酸组成，包含一个由18个氨基酸残基构成的信号肽，lumican核心蛋白包含一个亮氨酸高度重复的中央区，其两侧为二硫腱区域，其分子中心区具有4个天冬酰胺残基，能够进行n-糖基化链锁[7~9]。lumican不但有slrp家族的共同功能结构，还有自己独特的结构，在肿瘤的发生、发展中起到重要作用。

在癌细胞的增殖过程中，大多类型的癌细胞都显示出癌巢周围有不同程度的纤维化，这些纤维组织主要包括胶原纤维和成纤维细胞，它可以影响癌细胞增殖、迁移和扩散[10，11]。在胰腺癌的间质组织中lumican高表达与病人的存活期有关，lumican的高表达可以促进胰腺癌的生长和侵袭[12]。在乳腺癌组织中，lumican mrna在癌细胞周围的成纤维细胞中而非在癌细胞中过表达。lumican高表达与肿瘤病理分级高、癌组织中雌激素受体水平低和病人的低年龄相关。乳腺癌中lumican低表达与肿瘤快速进展和存活期短相关[13~15]。

yue ping lu等[16]通过免疫组化和原位杂交方法研究了12例人结直肠癌组织，其中8例癌细胞中有lumican mrna和蛋白强烈表达，在毗邻癌细胞的成纤维细胞中有较弱的表达，而在癌旁正常的结肠上皮细胞中则没有表达。本实验将100对标本制作在5张芯片上进行同步检测，避免了多次实验带来的系统误差。本实验对可供分析的94对结直肠癌及癌旁正常黏膜组织芯片研究显示，其中79例癌细胞中有lumican不同程度的表达，在毗邻癌细胞的成纤维细胞中有较弱的表达，而癌旁正常黏膜上皮组织中仅40例有lumican的表达且表达弱。部分癌旁正常黏膜上皮组织中有lumican的弱表达，与yue ping lu等[16]的研究结果不完全一致，可能与以下因素有关：①本实验在免疫组化过程中使用了抗原修复的方法；②实验所用抗体灵敏性；③是否进行了大样本研究。本研究发现lumican在结直肠癌组织中的表达强度显著高于癌旁正常黏膜（p<0.01），提示lumican在结直肠癌组织中的高表达可能在结直肠癌的发生发展中起重要作用。

seya t等[17]通过免疫组化方法对158例经外科手术治疗的伴早期淋巴结转移的结直肠癌研究发现，lumican高表达者生存率显著降低，lumican的高表达与淋巴结转移的范围和癌肿浸润深度相关，与年龄、性别、发病部位、组织分型及是否侵及淋巴管及静脉无关。而本实验研究显示，结直肠癌组织中lumican的表达强度与年龄、性别、发病部位、淋巴结转移及分化程度无关，与癌肿浸润深度存在非常显著的正相关(p=0.0078)及线性关系(p=0.0224)，即由肌层到浆膜外，lumican的表达强度逐渐增加。这可能与结直肠癌来源的lumican蛋白拥有更多非硫酸化或弱硫酸化的polylactosamine侧链有关[16]。含有非硫酸化或低硫酸化结构可以使细胞表面电荷数降低，帮助细胞进入有丝分裂，加快细胞增殖，还可以使细胞与周围胶原、纤黏蛋白、层黏连蛋白的亲和力下降，使细胞黏附性降低[18]。在结直肠癌中lumican有可能也是通过这些结构发挥作用，从而增强了癌细胞的侵袭能力。

在不同的组织分型中，lumican的表达强度有差异(p=0.0314)，即在结直肠腺癌中lumican的表达强度高于黏液腺癌及印戒细胞癌。在黏液腺癌及印戒细胞癌中lumican无强阳性表达，可能与其缺乏肿瘤间质组织，无法实现lumican与成纤维细胞之间通过tgf-β和smad信号途径进行的相互调节有关。本实验研究的结果与seya t等的结论不完全一致，可能与本实验是随机选取样本有关。lumican表达强度高与癌肿浸润深度及组织分型有关，而与淋巴结转移无关，提示lumican的异常表达可能是影响结直肠癌发生的早期事件之一。

综上，我们认为lumican在结直肠癌的发生发展中可能更多地通过肿瘤间质组织发挥作用，lumican表达强度越高癌细胞侵袭能力越强。当然，lumican对癌细胞的生长调控的潜在机制还未完全了解。有关lumican与生长因子之间相互作用的研究以及对lumican在细胞浆内的信号通路的研究，将有助于进一步了解lumican发挥作用的机制。

【参考文献】
[1] iozzo rv. proteoglycans: structure, function, and role in neoplasia[j]. lab invest, 1985, 53(4):373-396.

[2] iozzo rv. tumor stroma as a regulator of neoplastic behavior. agonistic and antagonistic elements embedded in the same connective tissue[j]. lab invest, 1995, 73(2):157-160.

[3] iozzo rv. neoplastic modulation of extracellular matrix. colon carcinoma cell release polypeptides that alter proteoglycan metabolism in colonic fibroblasts[j]. j biol chem, 1985, 260(12):7464-7473.

[4] moseley r, stewart je, stephens p, et al. extracellular matrix metabolites as potential biomarkers of disease activity in wound fluid lessons learned from other inflammatory diseases?[j]. br j dermatol, 2004, 150(3):401-413.

[5] ruoslahti e, yamaguchi y. proteoglycans as modulators of growth factor activities[j]. cell, 1991, 64(5):867-869.

[6] hardingham te,fosang aj. proteoglycans many forms and many functions[j]. faseb j, 1992, 6(3):861-870.

[7] chakravarti s, stallings rl, sundarraj n, et al. primary structure of human lumican(keratan sulfate proteoglycan) and localization of the gene(lum) to chromosome 12q21.3-q22[j]. genomics, 1995, 27(3):481-488.

[8] grover j, chen xn, korenberg jr, et al. the human lumican gene. organization, chromosomal location, and expression in articular cartilage[j]. j biol chem, 1995, 270(37):21942-21949.

[9] dunlevy jr, neame pj, vergnes jp, et al. identification of the n-linked oligosaccharide sites in chick corneal lumican and keratocan that receive keratan sulfate[j]. j biol chem, 1998, 273(16):9615-9621.

[10] hardingham te, fosang aj. proteoglycans: many forms and many functions[j]. faseb j, 1992, 6(3):861-870.