Pim—1激酶小分子抑制剂研究的现状和问题

　转《上海医药》

原癌基因pim-1是基因pim家族（现发现的有pim-1、pim-2、pim-3）中的一员，最早是作为莫洛尼小鼠白血病病毒（MoMuLV）的前病毒插入点被发现[1]，其编码的Pim-1激酶属于钙/钙调蛋白调节激酶（calcium/calmodulin-regulated kinase，CAMK），在多细胞组织的进化过程中高度保守。pim-2和pim-3是pim家族的另外两个成员，他们与pim-1分别具有55%和65%的同源性。
　　pim-1在调控细胞凋亡，分化，增殖以及肿瘤形成等方面发挥了非常重要的作用。Pim-1激酶能通过一个保守的甘氨酸环状基序磷酸化众多的在细胞凋亡、细胞周期调控中起重要作用的细胞因子，包括c-Myc，BAD，Socs1，Cdc25A，HP1，PAP-1，p21cip1/waf1，PTP-U2S，NFATc1等，从而导致肿瘤发生[2]。Pim-1对FLT3-ITD AML具有上调作用，其抑制剂AR00459339可以促进FLT3下游靶点STAT5，AKT，BAD的去磷酸化，对FLT3-ITD细胞如MV-4-11，Molm-14，和TF/ITD细胞系以及FLT3-ITD主要样品具有细胞毒性[3]。Pim-1通过直接磷酸化Cdc25C推进细胞周期G2/M的进程，促进细胞的增殖分化[4]。Pim-1还可通过与Socs1和Socs3抑制因子联合作用发挥其潜在的STAT5转录抑制作用。Pim-1能够与NFATcl转录因子结合并使其丝氨酸片段磷酸化，促进IL-2的生成，启动IL-2依赖的淋巴细胞的增殖和成熟[5]。最近研究表明Pim-1激酶在免疫调节、炎症（炎性肠疾病）以及新陈代谢和细胞增长中起着一定的作用[6-7]。通过抑制Pim-1激酶，还可以增强Runx3的表达和阻止TH2及TH17 T细胞变异，从而预防花生过敏[8]。
　　在癌细胞，如白血病，淋巴瘤，以及前列腺癌中过表达Pim-1具有致命作用[9]，而在正常细胞中没有。因此，与传统的化学治疗方法相比，抑制Pim-1激酶不会有有害的副反应。多种特异性和潜在的Pim-1激酶抑制剂也已经表现出诱导癌细胞凋亡，增加癌细胞对化疗的敏感性以及协同其他抗癌药物作用，如抑制Pim激酶可以增强苏尼替尼对肾细胞癌的活性[10]，Pim-1作用于Akt下游，可以调解地氟烷诱导和心肌缺血后适应性，增加心肌细胞存活[11]。Pim-1抑制剂ETP-45299与PI3K抑制剂GDC-0941合并使用，对MV-4-11 AML细胞有很强的协同作用[12]，与Bcl-2家族的小分子抑制剂ABT-737联合使用，体内和体外均引起前列腺癌细胞显著凋亡[13]。因此，Pim-1激酶是一个很有前景的治疗靶点。
　　1 Pim-1的结构特点
　　在典型的丝/苏氨酸或苏氨酸激酶中，ATP和铰链区形成两个氢键：一个是嘌呤的NH2作为供体与铰链的羰基形成氢键，另一个是受体在嘌呤N-1和激酶的骨架NH之间联系。在Pim家族中这个残基是脯氨酸，因此同样的氢键相互作用不存在（图1）[14-15]。由于铰链区脯氨酸残基Pro123的存在，Pim-1激酶区域仅通过一个氢键结合天然底物ATP。脯氨酸的存在使Pim-1与其他的激酶显著不同[16]。这个铰链区域是由Leu120，Glu121，Arg122和Pro123构成[9，17]，Pim-1结构另一个重要区域是富含谷氨酸磷酸盐结合弯曲部分（P-loop），包含氨基酸残基：Gly45，Ser46，Gly47，Gly48，Phe49和Gly50。嵌入物和脯氨酸共同引起了铰链区的扩张并形成了更大的空间，以便抑制剂占领并发挥作用。
2 作用于Pim-1的小分子抑制剂
　　近年来报道的有关Pim-1小分子抑制剂结构种类很多[9，17-22]。包括黄酮类、咪唑并[1，2-b]哒嗪、吡唑并[1，5-a]嘧啶和3-芳基-6-氨基-三唑并[4，3-b]哒嗪、苯亚甲基-噻唑烷-2，4-二酮、吡咯并[2，3-a]咔唑、苯并呋喃-2-羧酸类、取代的吡唑酮类、高效有机钌衍生物（III）等。黄酮类也抑制其他几种激酶，使得这些化合物作为Pim-1抑制剂的用途不是很清楚。咪唑并[1，2-b]-和三氮唑并[4，3-b]-哌嗪（II）是一种高效选择性Pim-1抑制剂，在纳摩尔浓度就有抑制活性[22-23]。此外，异噁唑并[3，4-b]喹啉酮及其类似物是一类在纳摩尔浓度就有效的高选择性的新型Pim-1和Pim-2抑制剂。
　　2.1 吲哚咔唑和二吲哚顺丁烯二酰亚胺衍生物
　　一些吲哚咔唑和二吲哚顺丁烯二酰亚胺衍生物具蛋白激酶抑制活性，研究发现星孢菌素和结构相关的二吲哚顺丁烯二酰亚胺类化合物1，2和3（图2）在1 ?mol/L时可产生90%的Pim-1抑制作用。这类化合物与Pim-1的结合特点表明，Pim-1铰链骨架通过Glu121的羰基氧与顺丁烯二酰亚胺的NH形成氢键作用，而Pro123的存在使得铰链区与顺丁烯二酰亚胺羰基无其他的氢键作用。尽管化合物1没有二面角构象，仍能很好的固定到ATP结合缝隙中，其吲哚部分被氨基酸残基Leu44，Phe49，Val52，Ala6，Ile104，Leu120，Leu174和Ile185通过疏水接触包裹，产生稳定的疏水作用力。
　　2.2 咪唑并[1，2-b]哒嗪类和吡唑并[1，5-a]嘧啶类
　　Bullock等[14]首次报道咪唑并[1，2-b]哒嗪类化合物4-6（图3）和吡唑并[1，5-a]嘧啶类化合物10（图3B）在纳摩尔浓度对Pim-1有抑制活性，且对Pim-1的选择性是Pim-2的100倍[14]。化合物4具有抗白血病活性，X光衍射显示化合物4结合到Pim-1的ATP结合位点上，Lys67的N-1位的氮原子参与氢键作用，抑制剂与残基Leu44，Phe49，Ile104和Leu120之间有疏水稳定作用。化合物5诱导人白血病细胞系MV-4-11凋亡，减少Pim下游靶点的磷酸化；在体外可减少初期白血病的发生。咪唑并[1，2-b]哒嗪类（图3A）被认为是ATP竞争性抑制剂而不是ATP类似物[1，24-25]。在各种咪唑并[1，2-b]哒嗪中化合物8和9（图3A）活性较好。进一步构效关系研究发现R2疏水作用对选择性和去溶剂化的影响不大，R1对活性影响较大。R1、R2结构优化获得的化合物6对Pim-1的IC50是39 nmol/L。
　　ETP-45299是一个有效的选择性Pim-1抑制剂，能抑制Bad和4EBP1的磷酸化，阻止人细胞系中实体瘤和非实体瘤细胞的增殖。ETP-45299与PI3K抑制剂GDC-0941合并使用，对MV-4-11 AML细胞有很强的协同作用，这表明合并使用选择性Pim激酶抑制与PI3K抑制剂可能会产生很好的临床效益[12]。
　　SGI-1776是由SuperGen公司最初通过虚拟筛选得到的一个化合物，已进入I期临床试验。该化合物对Pim-1，Pim-2，Pim-3都具有较高的抑制作用，能够诱导慢性淋巴细胞白血病细胞的凋亡；最近Hospital等[26]提出SGI-1776抗白血病的机制是直接抑制FLT3激酶在AML中的活性。SGI-1776还可以诱导前列腺癌细胞中的细胞周期停滞和凋亡，与雄性激素-依赖性细胞相比，在雄性非依赖细胞中具有显著的细胞毒性效 应。最重要的是SGI-1776可使对化疗药物耐药的前列腺癌细胞系对紫杉醇再敏化。体内肿瘤模型实验初步研究显示SGI-1776具有治疗效果[27]。
　　2.3 异噁唑并[3，4-b]喹啉-3，4（1H，9H）-二酮类
　　以异噁唑并[3，4-b]喹啉-3，4（1H，9H）-二酮为骨架的化合物，最初是由Abbott实验室开发作为Pim-1抑制剂，其中化合物11（图4A）在纳摩尔浓度对Pim具有抑制活性，化合物12（图4A）对Pim-1的抑制作用是IC50=2.5 nmol/L，是该类中最高效的Pim-1抑制剂。Abbott实验室进一步研究得到的化合物13（图4A）对Pim具有很高的抑制活性和选择性（IC50=2.5 nmol/L）。研究以异噁唑并[3，4-b]喹啉-3，4-（1H，9H）-二酮为骨架作为潜在的Pim-1和Pim-2激酶抑制剂的构效关系表明，R2可以为多种烷基基团，R3只能是小基团，如质子，甲基，以维持分子的抑制活性[18]。
　　2.4 吡啶酮类衍生物
　　吡啶酮类衍生物是Valeant Pharmaceuticals R&D从160 000个化合物中筛选得到[19]，其中化合物14（图4B）活性最高（IC50=50 nmol/L），这一类化合物与Pim-1的复合物X光-单晶衍射分析推测，该类化合物是ATP竞争性抑制剂。化合物14与铰链区唯一有潜在相互作用的部位是R1苯环的左侧，这个复杂的结构被定义为Glu121的主要羰基与R1芳香氢（C-3）的弱氢键作用（C=O…H-C）。Glu121的羰基与芳香族C-4的氢之间的氢键可能也有助于稳定化合物14与Pim-1的铰链区。化合物14的结合可竞争性地抑制ATP的利用，从而抑制了Pim-1的功能[19]。
　　2.5 苯亚甲基-噻唑烷-2，4-二酮类[28]
　　5-苯基苄烯基噻唑-2，4-二酮类是一类新的Pim-1和Pim-2抑制剂[17]，IC50在纳摩尔浓度范围。这类化合物体外可以阻断Pim磷酸化多肽和蛋白质，并抑制前列腺癌细胞和白血病细胞在细胞周期G1阶段的生长。化合物15（图5A）是从ChemBridge化合物库中筛选获得，对Pim-1和Pim-2的抑制作用分别是IC50=24 nmol/L和0.1 ?mol/L。化合物16（图5A）对Pim-1的抑制作用稍强（IC50=13 nmol/L），而对Pim-2的抑制作用稍低（IC50=2.3 ?mol/L）。
　2.6 3-芳基-6氨基-三唑并[4，3-b]哒嗪类[15]
　　X光-单晶衍射显示化合物17（图5B）与Pim-1结合方式与化合物4结合的方式不同，在化合物17与Pim-1结合的复合物中m-CF3-苯环通过两部分氢键即芳香环C-5和C-6位上的质子与Glu121骨架羰基之间的氢键与铰链区的Glu121连接。
　　化合物17虽然是有效的Pim-1选择性抑制剂，但是其物理性质限制了其应用。以化合物17为先导化合物，R用哌啶基取代得到化合物18（图5B），其溶解度得到改善（pH 7.4时溶解度大于200 ?mol/L），而活性不变。
　　2.7 吡咯并[2，3-a]咔唑类
　　以吡咯并[2，3-a]咔唑为骨架的Pim抑制剂，C-6位被溴原子取代得到化合物19（图5C），对Pim-1有很好的抑制作用（IC50=6.8 nmol/L）。C-6位溴原子与Glu121骨架羰基之间的排斥力可能是化合物19与Pim-1的一个额外相互作用力[28]。对吡咯并[2，3-a]咔唑C-3位改造，可合成新的Pim激酶的选择性抑制剂（化合物20，21，22和23）。体外实验测试表明，这类化合物均具有纳摩尔浓度级的Pim激酶抑制活性。
　　2.8 喹啉类衍生物
　　Sliman等[29]报道了一系列7-羰基-8-羟基喹啉衍生物（图6A）对Pim-1具有抑制作用。其中化合物24活性最好（IC50=0.4 ?mol/L）。这些活性化合物是以8-羟基喹啉-7-碳酸为核心，分子对接实验表明杂环部分在Pim-1结合位点被精确放置，芳香环和Phe49苯环的疏水作用可以产生很高的抑制活性，辅助环通过氢键作用增强这种作用，而R1、R2、R3、R4四个取代基中最多同时含有一个羟基，另外三个取代基为氢时活性较好，如化合物25（IC50=0.5 ?mol/L）。
　　A47与咪唑并[1，2-b]哒嗪类化合物的作用方式一致，显著地损坏鼠科动物依赖Pim-1过表达的VaF3细胞转变成IL3细胞过程[30]，这表明A47的抗癌活性部分是通过调节Pim-1活性实现。
　　2.9 苯并呋喃-2-羧酸类
　　这类化合物（图6B）的作用模式是：①苯并呋喃5-位取代基与ATP铰链区疏水口袋之间的疏水相互作用是非常重要的结合作用。②2-羧酸基团与Lys67的盐桥作用和Glu89与Asp186之间的氢键作用被认为是另一个非常重要的结合位点。③门看守位置（gate keeper site）附近的多余取代不适合。④在核糖结合区域存在潜在的空间以用于结构扩张。研究发现2-羧酸基团与末端氨基之间的氢键作用很重要。其代表者主要有化合物26和27[31]。
　　3 其他化合物
　　Anizon等[32]报道一系列的有机金属复合物（28～30）（图7）。这类化合物都含一个平面的杂环骨架，一个Ru的双齿配体，激酶抑制活性低于纳摩尔。吡啶咔唑和金属复合物部分占领与星孢菌素的吲哚咔唑和碳酸酯碎片相同的结合位点。化合物31～33（图7）是混合型Pim激酶抑制剂，对Pim-1和Pim-2均有抑制作用。
　　Tsuganezawa等[33]采用荧光关联能色谱法从700个化合物中虚拟筛选出的化合物34（图7），对Pim-1有抑制作用，体外IC50为150 nmol/L，单晶衍射分析化合物34与Pim-1的复合物结构，发现化合物34主要作用于ATP结合位点，并与残基Asp128和Glu171直接作用。Sarno等[34]发现ATP位点导向的蛋白激酶CK2抑制剂NBC（Ki=0.22 μmol/L），对Pim激酶也有抑制作用，尤其是对Pim-1和Pim-3，抑制活性与CK2相当。去硝基得到的dNBC对CK2的抑制活性几乎完全丧失（IC50大于30 μmol/L），而对Pim-1和Pim-3的抑制作用不变。
　　4 小结
　　Pim-1蛋白作为新的抗肿瘤靶点，具有较高的选择性，近年来越来越被关注。与Pim?-1相互作用的小分子抑制剂结构类型多样，暗示Pim-1抑制剂在肿瘤细胞中能钝化多个靶点。
　　咪唑并[1，2-b]哌嗪类与Pim-1激酶结合部位相对于ATP类似物抑制剂在利用激酶P-loop时相当特别。很明显还有很大空间优化这类配体小分子，以提高其Pim-1激酶抑制活性。SGI-1776作为唯一一个进入临床试验的小分子抑制剂，对Pim-1，Pim-2，Pim-3都具有较高的抑制作用，对慢性淋巴细胞白血病和前列腺癌细胞具有显著的细胞毒性效应。5-（3-三氟甲氧基苄烯基）噻唑烷-2，4-二酮可以减少Pim-1在完整细胞中的自动磷酸化，是ATP竞争性抑制剂，对Pim激酶具有选择性。由于Pim-1激酶在正常细胞中作用不明显，以及Pim-1激酶的独特结构，使得结构多样性的Pim-1小分子抑制 剂不会产生很大的副作用，尽管目前还没有Pim-1激酶抑制剂上市，但是这些研究成果为开发新靶点的抗肿瘤药物提供了思路。
　　参考文献
　　[1] Kumar A， Mandiyan V， Suzuki Y， et al. Crystal structures of proto-oncogene kinase Pim1： a target of aberrant somatic hypermutations in diffuse large cell lymphoma[J]. J Mol Biol， 2005， 348（1）： 183-193.
　　. Future Oncol， 2010， 6（9）： 1461-1478.