石榴皮提取物中鞣花酸和没食子酸在大鼠体内的

R285 A 1673-7210（2015）01（c）-0019-05
　　石榴（Punica granatum L.），又叫安石榴，属于石榴科石榴属的一种落叶果树，广泛栽培于热带和亚热带地区。中医认为石榴皮在涩肠、止血、杀虫方面具有显著的功效，故作为一种传统的中药材一直收载于《中国药典》中。《中国药典》2010年版规定石榴皮中鞣质含量不得低于10%，这说明鞣质类成分是衡量石榴皮质量好坏的重要指标，而总鞣质中的主要活性成分就是鞣花酸和没食子酸。本实验室在前期的研究中已经证实石榴皮中总鞣质具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抑精抗生育活性、改善慢性肾功能等作用。现代研究证实其除了具有强大的抗氧化、抗菌、抗病毒作用外，在体外还可抑制癌细胞增殖，诱导细胞凋亡。目前，还尚未有同时对鞣花酸和没食子酸的药代动力学研究的报道。本实验采用口服方式给予大鼠石榴皮提取物，并运用高效液相色谱法测定鞣花酸和没食子酸在大鼠体内的血药浓度，从而研究这两种成分在大鼠体内的药代动力学特征，为进一步研究石榴皮鞣质成分提供参考。
　　1 仪器与试药
　　1.1 仪器
　　高效液相色谱仪（Aligent 1100，US）；超声波清洗仪（SK5200H，上海科导超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（W2-100S，上海申生科技有限公司）；冷冻干燥机（ALPHAI-4/RZ-2，Martin Christ，GER）；冷冻离心机（H-1600RW，上海利鑫坚离心机有限公司）。
　　1.2 试剂与药品
　　石榴皮采购于武汉市药材公司，并由武汉大学药学院张洪教授鉴定为石榴科石榴属石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮；大孔吸附树脂（HPD，沧州宝恩化工有限公司）；鞣花酸对照品（批号：A0714，成都曼斯特生物科技有限公司）；没食子酸对照品（批号：110831-201204，中国药品生物制品检定所），干酪素（上海伯奥生物科技公司）；肝素钠（天津市生物化学制剂厂）；水是实验室自制的超纯水；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
　　1.3 实验动物
　　健康雌性SD大鼠10只，体重180～220 g，购于武汉大学实验动物中心，许可证号为SCXK（鄂）2008-0005。将大鼠采取自然光照和自由进食进水，饲养在武汉大学人民医院SPF级动物房中，适应1周后开始实验。
　　2方法
　　2.1 石榴皮提取物制备
　　2.1.1 石榴皮鞣质粗提物的制备
　　将粉碎后的一定量的干燥石榴皮置于1000 mL蒸馏烧瓶中，按1∶10的料液比，用70%丙酮溶液作为溶剂在50℃下回流提取两次，每次30 min。然后合并两次提取液，趁热过滤，再于50℃下减压浓缩并回收溶剂，浓缩液冷冻干燥后得粗提物，并保存于4℃冰箱中供实验用。
　　2.1.2 磷钼钨酸-干酪素比色法测定鞣质含量
　　2.1.2.1 对照品溶液的配制
　　将精密称取的50 mg没食子酸对照品置于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解，稀释至相应刻度并摇匀。再精密量取上述溶液5 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀，即可得到0.05 mg/mL的没食子酸对照品溶液。
　　2.1.2.2 标准曲线的制备
　　分别对6个25 mL棕色容量瓶进行编号，依次向编号的容量瓶中加入没食子酸对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL。然后各加入磷钼钨酸试液1 mL，再分别加水12、11、10、9、8、7 mL，最后分别用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30 min后，于760 nm波长处用紫外分光光度法测定吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线为：Y=110.95X+0.0194，r=0.9998。结果见图1。
　　2.1.2.3 鞣质含量测定  
　　2.1.2.3.1 总酚 精密吸取样品溶液2 mL，置于25 mL棕色量瓶中，按照“2.1.2.2”项下的方法测定吸光度，并从标准曲线中读出待测样品溶液中相应没食子酸的含量（mg），计算即可得到总酚的量。
　　2.1.2.3.2 不被吸附的多酚 先精密量取25 mL的样品溶液，然后加至盛有0.6 g干酪素的100 mL具塞锥形瓶中，密塞后置于30℃水浴中保温1 h，搅拌，取出后放冷，摇匀并过滤，弃去初滤液。精密量取续滤液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，“2.1.2.2”项下的方法测定相应的吸光度，并从标准曲线中读出待测供试品溶液中没食子酸的含量（mg），计算即可。鞣质的含量按下式计算得到：鞣质的含量=总酚的含量-不被吸附的多酚量。
　2.1.3大孔吸附树脂富集纯化石榴皮总鞣质
　　将制备得到的石榴皮鞣质粗提物冻干粉用蒸馏水溶解，配制成浓度为4.35 mg/mL上样液。取HPD-400型大孔吸附树脂25 g，湿法装柱，将石榴皮鞣质样品液以2 BV/h的流速上样吸附，上柱量为5 BV后（吸附柱中树脂装填量的倍数）。水洗除杂，然后用2 BV 70%乙醇洗脱后即可解吸完全，解吸率为93.94%，收集洗脱液，回收乙醇，经HPD-400树脂纯化后，磷钼钨酸-干酪素比色法测定鞣质含量，结果终产品中总鞣质的纯度为55.62%，减压干燥得到提取物的浸膏，冷冻干燥，4℃冰箱保存备用。
　　2.2 标准储液的制备
　　精密称取鞣花酸、没食子酸对照品1.74 mg于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，即制得鞣花酸的标准储备液。
　　2.3 色谱条件
　　2.3.1 鞣花酸色谱柱
　　Venusil MP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.2%磷酸-乙腈=77∶23；DAD检测波长：256 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：40℃。
　　2.3.2 没食子酸色谱柱
　　Venusil MP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。A相：0.1%磷酸水溶液，B相：0.1%磷酸乙腈溶液。DAD检测波长为280 nm；流速0.8 mL/min；柱温：40℃。梯度洗脱条件：0～5.0 min，95%A；5.0～6.5 min，95%～93%A；6.5～8.5 min，93%A；8.5～13.73 min，93%～75%A；13.73～14.39 min，75%～10%A；14.39～17.0 min，10%～95%A。
　　2.4 标准曲线的绘制
　　取肝素抗凝的空白血浆5份，于3000 r/min，4℃条件下离心10 min，取上清液0.5 mL。为了沉淀其中的蛋白加入0.5 mL甲醇溶液，在4℃条件下采用10 000 r/min离心10 min，然后在上清液中分别加入各100 μL不同浓度的鞣花酸、没食子酸溶液，最后混合均匀配制浓度8.7、6.3、4.35、2.175、1.0875 μg/mL的血浆样品，每次进样20 &mu ;L。
　　2.5 动物分组与给药
　　将10只雌性的SD大鼠随机分为给药组和空白对照组，每组5只，在SPF级动物房中适应周围环境一周后就开始实验。实验给药前，将大鼠置于代谢笼中禁食12 h，自由饮水，用于收集空白血样。而给药组给大鼠口服3 g/kg石榴皮提取物，空白组给予等量的生理盐水。给药后，用10%的水合氯醛麻醉后，从心脏取血，收集给药后15、30、45 min，1、1.5、2、4、8 h的血样。肝素抗凝后，分离血浆，-20℃冷冻保存。每个样品取1 mL，按“2.4”项下方法处理样品。
　　2.6 统计学方法
　　运用WinNonlin 5.2药代动力学软件对大鼠体内的血药浓度一时间数据进行处理，从而判断房室模型并计算出相关的药代动力学参数。
　　3 结果
　　3.1 鞣花酸、没食子酸的标准曲线
　　结果显示提取物的线性范围为0.5～8.7 μg/mL，在此范围内鞣花酸标准曲线为：Y=145.46X-157.01（r=0.9989），其中X代表鞣花酸浓度（μg/mL），Y代表峰面积。没食子酸标准曲线为：Y=110.95X+0.0194（r=0.9998），其中X代表没食子酸浓度（μg/mL），Y代表峰面积。
　　3.2 高效液相色谱分析
　　各溶液的高效液相色谱结果见图2。
　　3.3 精密度与回收率试验
　　取低、中、高不同浓度的血浆样品，根据标准曲线计算相应各自的回收率。将上述样品连续测定5 d，并且在一日内重复测定5次，分别得到日间和日内精密度。结果见表1。
　　由表1可见此实验回收率良好，方法准确。精密度满足此实验分析方法的要求，此方法可用于样品的测定。
　　3.4 大鼠体内药代动力学研究
　　3.4.1 口服石榴皮提取物后大鼠体内鞣花酸、没食子酸血药浓度-时间曲线
　　具体的血药浓度-时间曲线见图3。
　　3.4.2 药代曲线的拟合和药代参数
　　通过WinNonlin 5.2软件拟合，采用房室模型方法计算药动学参数。主要药动学参数见表2。
　　4 讨论
　　本试验采用磷钼钨酸-干酪素比色法测定鞣质含量方法，操作简便，结果可靠，重现性好，可作为石榴皮中鞣质的检测方法。处理血浆样品时，蛋白质必须沉淀完全，笔者对不同的溶剂及配比进行摸索，发现沉淀蛋白时在0～4℃条件下进行较好，血浆量与甲醇比为1∶1时，沉淀完全且效果比乙腈好。
　　本实验通过建立测定大鼠血浆中鞣质浓度的高效液相色谱方法，选用乙腈和磷酸水溶液做流动相，因为鞣质是一种弱酸性物质，口服后在胃内的酸性环境中，磷酸可有效对鞣花酸起到离子化抑制作用，使其与杂质峰达到很好的分离。实验结果表明鞣质中各成分的色谱峰能得到良好的分离，相应的标准曲线相关系数良好，最低检测限为0.5 μg/mL，高、中、低3个浓度的回收率均大于90%。此方法操作简便、测定准确，可重现性很好，适合用于药物代谢的研究。
　　给大鼠口服石榴皮鞣质提取物后，通过WinNonlin 5.2软件分析药代动力学的各项参数，发现其药代动力学过程选择权重系数为1/C2，描述为开放的二室模型较为合理，没食子酸吸收速率常数（Ka）为0.889 h-1，吸收相生物半衰期（T1/2（ka））为0.779 h-1，表明没食子酸在体内吸收快，达峰时间（Tmax）约为1.38 h，比鞣花酸所需的时间要长，这可能是其与鞣花酸等其他成分的竞争性吸收有关。分布相生物半衰期（T1/2α）为0.856 h-1，说明没食子酸能较快的向组织分布；消除相生物半衰期（T1/2β）为5.59 h-1，说明在体内中速消除。而与此相比，鞣花酸在体内吸收更迅速，半小时左右血药浓度可以达峰值，约7.29 μg/mL；鞣花酸在体内的分布速度相对于没食子酸而言也很快，药物从中央室迅速向外周室转运，使得血药浓度迅速下降，在口服给药约57 min后，血药浓度下降到之前的一半；但相对于没食子酸而言，鞣花酸的消除速度并不快，T1/2β为6.73 h-1。Lei等研究发现石榴叶鞣质中鞣花酸在大鼠体内是快速吸收、分布以及消除。与此相对比，从药-时曲线中可以看到在给大鼠口服石榴皮提取物后，鞣花酸在体内0.5 h左右达到峰值，峰面积较大且符合二室模型，但鞣花酸在大鼠体内的消除速率较缓慢。这说明口服给予鞣花酸吸收分部较迅速，并维持一定的血药浓度，从而延长给药间隔时间，减少给药次数。基于这种药动学特征，研究石榴皮提取物中鞣花酸和没食子酸的适宜剂型，确定其主要代谢产物的生物活性，将是今后研究的命题。
　
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