熊果酸对膀胱癌T24细胞生长的影响

熊果酸对膀胱癌t24细胞生长的影响

【关键词】 膀胱癌;熊果酸;血管内皮细胞;靶点

【摘要】 目的 探讨三萜类化合物熊果酸(ua)对人膀胱癌t24细胞增殖、迁移及裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用及其机制。方法 应用熊果酸处理体外培养的人膀胱癌t24细胞，四甲基偶氮唑蓝(mtt)比色法、细胞迁移法检测ua对t24细胞的增殖抑制效应;建立膀胱癌皮下移植瘤模型，观察ua对移植瘤的生长抑制作用。结果 体内﹑外实验结果显示：各治疗组ua能较明显抑制t24细胞增殖、迁移，并在48 h抑制作用明显。 在体内使裸鼠皮下移植瘤体积明显缩小，并表现具有一定的剂量时间依赖关系。结论 ua能明显抑制肿瘤细胞生成，其作用靶点可能为肿瘤新生血管内皮细胞。

【关键词】 膀胱癌;熊果酸;血管内皮细胞;靶点

　熊果酸(ursolic acid,ua)，又名乌苏酸﹑乌索酸，属五环三萜类化合物，存在于白花蛇舌草﹑山楂,女贞子等许多天然药物中，具有保肝﹑降脂﹑免疫调节﹑抗感染﹑抗氧化及抗肿瘤等作用〔1〕。近年来研究发现,ua不仅对多种致癌物和促癌物有抵抗作用,而且对多种恶性肿瘤细胞生长有抑制作用〔2，3〕。本文采用不同浓度的ua处理人膀胱癌t24细胞，通过体外实验及体内裸鼠移植瘤模型,观察ua对膀胱癌t24细胞及裸鼠移植瘤生长抑制的影响，为开发一种新的治疗膀胱癌药物提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　ua，美国sigma公司，批号：77521;hyclone胎牛血清，赛默飞世尔生物化学制造(北京)有限公司，批号：nva0227;二甲基亚砜(dmso)，美国amresco公司生产;噻唑蓝，北京鼎国生物技术有限责任公司;imdm培养基，美国海克隆生物化学制品;人vegf，美国 prospectany technogene 公司。co2培养箱，日本sanyo;超净工作台，苏州净化备厂生产;倒置显微镜，日本olympus公司;酶标仪，日本eyela公司。

　　1.2 动物与细胞来源

　　人膀胱癌t24细胞由吉林大学前列腺疾病防治研究中心惠赠;balb/c nu/nu裸鼠，6～8周龄，体重18～22 g，购自北京市维通利华实验动物技术有限公司。

　　1.3 动物模型制备、分组及给药

　　取对数生长期的t24细胞，用胰酶消化，调整活细胞浓度为5×106/ml，每只裸鼠腹股沟皮下接种上述单细胞悬液0.2 ml后，将裸鼠随机分为3组，每组10只，分别为对照组﹑姜黄素组及ua组。并在第2天开始给药，姜黄素及ua浓度分别为2、10 mg/kg，腹股沟皮下注射1次/d，对照组注射等量生理盐水，连续治疗21 d，末次给药后24 h处死动物，计算肿瘤体积的变化，体积=0.52×长径×短径×短径。

　　1.4 t24细胞增殖活性的检测

　　将t24细胞悬浮液加于96孔细胞培养板，每孔接种1×104细胞，同时添加vegf终浓度为1 ng/ml。每个处理设6个复孔，同时加入待测样品，ua终浓度分别为60、70、80 μmol/l;姜黄素浓度为13 μmol/l，对照组加入(dsmo);37℃，5% co2条件下，分别培养24、48、72 h后，每孔内添加终浓度为5 mg/ml mtt，在37℃，5% co2条件下继续培养4 h，弃含mtt的细胞培养液，并用pbs轻洗1～2次，每孔加入100 μl dmso轻微振荡器上振荡5 min，使其mtt被还原形成的蓝紫色结晶彻底溶解，用modeldg3022酶联免疫检测仪490 nm波长测od值，求出ic50值。

　　1.5 t24细胞迁移的检测

　　35 mm细胞培养皿接种5×105个t24细胞，单层培养至细胞覆盖率为95%左右，弃原培养液后，用灭菌双面剃须刀片在培养皿中央划一道线，再用细胞刮轻轻刮去一侧的细胞，并用新鲜imdm培养液轻洗培养皿内细胞3次，吸去残液，培养皿内添加新鲜培养液3 ml，同时添加vegf终浓度为1ng/ml和ua浓度分别为60、70、80 μmol/l的溶液，姜黄素浓度为13 μmol/l，在37℃、5% co2培养48 h，弃原培养液，甲醇浓度(99%)固定细胞10 min，用1 ml瑞氏色素染色，15～20 min后，用双蒸水冲洗2次，自然干燥或37℃恒温箱内干燥， 在刮痕整齐侧随机选3个视野拍照，细胞计数。

　　1.6 统计学分析

　　采用spss13.0统计软件处理，计量资料以x±s表示，多个样本的两组间比较采用snkq检验。

　　2 结 果

　　2.1 ua对膀胱癌t24细胞增殖影响

　　正常对照组细胞呈正常对数生长，而ua及姜黄素组在24 h表现出增殖抑制作用，与对照组比较有显著差异(p<0.05),在作用48 h及72 h表现出极显著的增殖抑制作用，与对照组比较有极显著性差异(p<0.01)，提示ua能显著抑制膀胱癌t24细胞增殖，并具有药物作用剂量效应和时间效应。见表1，图1。

　　2.2 ua对膀胱癌t24细胞迁移的影响

　　ua对膀胱癌t24细胞迁移(48 h)具有明显的抑制作用，与对照组比较有显著差异(p<0.01),并且其迁移抑制作用具有一定的时间剂量依赖关系。见表1，图2。图1 ua作用48 h后对各组膀胱癌t24细胞增殖抑制作用(×200)　图2 ua对膀胱癌t24细胞增殖抑制作用(48 h)(×200)表1 ua对膀胱癌t24细胞增殖抑制作用及细胞迁移的影响

　　2.3 ua对裸鼠移植肿瘤抑制作用

　　连续治疗裸鼠皮下移植肿瘤21 d后，ua能明显抑制肿瘤生长，与模型组比较有显著性差异(p<0.05),其抑制率为71.5%;在裸鼠体重方面，各组间鼠重无显著性差异，与实验前相比体重改变也不明显。见表2。表2 熊果酸对裸鼠肿瘤抑制作用

　　3 讨 论

　　近几年研究表明ua可通过细胞毒作用、增殖抑制、诱导凋亡、抑制肿瘤血管形成等多种机制发挥抗肿瘤作用、对人类卵巢癌细胞skov3系、mcf7乳腺癌细胞系等多种肿瘤均有较强的抑制作用〔4〕，本研究显示，随着ua药物浓度从60 μmol/l增加到80 μmol/l，作用时间从24 h至48 h，ua能明显抑制膀胱癌t24细胞增殖﹑迁移，并具有药物作用剂量效应和时间效应。与正常对照组比较有显著性差异。在瘤体边缘皮下注射ua浓度10 mg/kg，1次/d，连续治疗21 d，能使肿瘤体积明显缩小，抑制率达71.5%，与正常对照组比较有显著性意义。提示ua抑制血管退化同时，可以引起瘤体的消退，肿瘤体积明显缩小，体重未见明显变化，无异常反应及死亡。本研究通过体外实验与动物实验均证明了ua具有明显抗肿瘤血管生成的活性。并且在细胞水平和整体水平的结果具有一定的相关性，其作用机制可能直接作用靶点为新生血管内皮细胞，抑制肿瘤血管生成，使肿瘤处于无血管期，从而抑制肿瘤血管生成。ua有望成为一种新型的抗肿瘤药物。

【参考文献】
　1 tian z，lin c，zheng rx,et patoma activity and mechanism of ursolic acid and its derivatives isolated from aralia decaisneana〔j〕. world j gastroenterol，2006;12:8749.

　　2 ikeda y，murakami a，ohigashi c acid，an antiand proinflammatory triterpenoid〔j〕.mol nutr food res，2008;52:2642.

　　3 tsai sj，yin inflammaatory protection of oleanolic acid ursolic acid in pc12 cells〔j〕.j food sci，2008;73:1748.

　　4 杨晓文,崔 明,莫 平.熊果酸对mcf7乳腺癌细胞生长的影响〔j〕.中华实验外科杂志，2009;4:43941.

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