FasL、抗人DR5单克隆抗体诱导肿瘤细胞凋亡

【摘要】 目的：探讨fasl、antidr5 mab对肿瘤细胞hela、bgc823、mcf7、l342、h9101、d6的杀伤作用及机制。方法：采用rtpcr、mtt比色法、电泳、dna倍体分析、western blot等方法。结果：h9101、hela细胞株dr5 mrna水平有表达，d6细胞无表达；h9101、l342细胞株fas mrna水平有表达，d6细胞无表达。h9101、l342细胞株对fasl、antidr5 mab敏感并呈剂量依赖性；mcf7、bgc823细胞株对fasl敏感，对antidr5 mab相对敏感。hela对fasl相对敏感，对antidr5 mab敏感；d6对两种凋亡诱导剂耐受。结论：fasl、antidr5 mab能不同程度地诱导肿瘤细胞凋亡, 其机制与fas、dr5、caspase8、bcl2的表达有关。

【关键词】 fasl 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 死亡受体 凋亡

　　fas ligand and antihuman dr5 monoclonal antibody induce tumor cell lines apoptosis

　　song yuguo，li wenzhu，li ying，chen caixia，zhuang guohong.

　　beihua university, jilin 132013, china

　　［abstract］ objective:to study the cytotoxic effects on tumor cell lines hela,bgc823,mcf7,l342,h9101,d6 induced by fas ligand and antihuman dr5 monoclonal antibodies(antidr5 mab) and the underlying s:fas/dr5 mrna were detected by rtpcr. cytotoxicity exerted by fasl/antidr5 mab on tumor cell lines was measured by mtt colorimetry and the induced apoptosis was determined by agarose gel s:the expression of dr5 on bgc823 and hela cells were higher and dr5 didn’t express in d6. the expression of fas on h9101 and l342 were higher and fas didn’t express in d6. cell line h9101 and l342 were sensitive to antidr5 mab and fasl in a dose dependent manner; cell line mcf7 and bgc823 were sensitive to fasl but were partially sensitive to antidr5 mab; cell line hela was partially sensitive to fasl but was sensitive to antidr5 mab; cell line d6 was insensitive to two apoptosis sion:apoptosis induced by fas ligand and antidr5 mab vary among tumor cell lines. the underlying mechanism may be relevant to fas/dr5 mrna expression，the release of caspase8 and bcl2.

　　［key words］ fasl；trail；death receptor；apoptosis

　　细胞凋亡是细胞启动自杀程序后的一种死亡形式，在维持细胞正常死亡与分裂的平衡中起重要作用。已证实诱导细胞凋亡的信号传递受体配体对有三组，分别为tnf/tnfr1、fas(cd95)/fasl和trail(tnf related apoptosis inducing ligand)(apo2l)/dr4、dr5［1］。人类许多疾病如肿瘤,自身免疫疾病及变性疾病均与细胞凋亡有关。

　　细胞表面的凋亡受体fas蛋白，在与其配基fasl结合后,可启动细胞内凋亡信号通路,通过一系列的分子事件，使细胞发生凋亡［2］。

　　trail能通过其死亡受体（dr4,dr5）选择性地诱导多数肿瘤细胞凋亡。死亡受体dr5在传递trail的死亡信号，诱导肿瘤细胞凋亡中起重要作用。人们已经构建了许多trail重组体，并作了大量功能实验。现有的研究证实，trail对于大多数来自骨髓、前列腺、乳腺、肺、肾、脑和皮肤的恶性肿瘤有抑制细胞生长和细胞毒效应，但trail的肝毒性严重限制了其临床应用，因此寻找高效低毒的死亡受体激活剂成为研究目标。ichikawa 等［3］制备了抗dr5单克隆抗体tra8，并发现tra8对正常肝细胞没有凋亡作用,而原发性及转移性肝细胞癌对tra8敏感。目前以死亡受体为靶点的肿瘤生物治疗是该领域的研究热点。

　　该实验利用fasl、抗dr5单克隆抗体（antidr5 mab）研究其对肿瘤细胞株hela、bgc823、mcf7、l342、h9101、d6的杀伤作用及其机制，为临床肿瘤的治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 实验所用fasl蛋白、antidr5 mab由本实验室制备。所用肿瘤细胞株hela（宫颈癌）、bgc823（胃癌）、mcf7（乳腺癌）、l342（肺腺癌）、d6（肺腺癌）、h9101（肝癌）由本中心保存。抗caspase8、bcl2单克隆抗体为sigma公司产品，hrp羊抗兔igg购自promega公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 rtpcr分析fas、dr5 mrna的表达 参照文献［4］。

　　1.2.2 mtt法检测fasl、antidr5 mab对hela、bgc823、mcf7、l342、h9101、d6细胞增殖的抑制作用 计数细胞，5×105/孔接种培养板，按50.0、25.0、12.5、6.25、3.125及1.562 5 μg/ml加入fasl及antidr5 mab，培养4小时。加入20 μl mtt（7.5 g/l）继续培养4小时，加100 μl异丙醇，于波长570 nm测定吸光度（a）值，并计算抑制率（%）。实验重复3次，取其平均值。

　　抑制率=1-实验组的a值对照组的a值×100%。

　　1.2.3 琼脂糖凝胶电泳 细胞处理同前，收集细胞，调细胞浓度为1×106 ml-1，然后参照文献［4］进行琼脂糖凝胶电泳。

　　1.2.4 western blot检测细胞内caspase8、bcl2的蛋白表达 ①sdspage：收集细胞提取蛋白，然后进行sdspage分离蛋白质。②转膜：把分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜。③agab反应：加入一抗，反应1小时，洗涤液洗涤3次；加入hrp标记的二抗，反应1小时，洗涤。④显色：dab显色。

　　1.3 统计学分析 所有数据采用x±s表示，每种实验重复3次，计算其平均值。

　　2 结果

　　2.1 fas、dr5在肿瘤细胞的mrna水平表达 通过rtpcr检测fas、dr5 mrna在6株肿瘤细胞的表达情况。结果提示fas、dr5 mrna在不同肿瘤细胞的表达情况不同，其中fas mrna在l342、h9101中有表达，d6中无表达；dr5 mrna在hela、h9101中有表达，d6中无表达。fas表达在240 bp，dr5表达在502 bp，电泳结果与理论计算值相符，见图1。

　　2.2 fasl、antidr5 mab对肿瘤细胞株杀伤的研究

　　2.2.1 fasl、antidr5 mab对细胞生长的影响 经mtt法分析发现，肿瘤细胞株hela、bgc823、mcf7、l342、h9101、d6对fasl/antidr5 mab敏感性不同,组间差异显著。h9101、l342对antidr5 mab敏感，表现为细胞死亡率与浓度升高成比例；mcf7对fasl敏感，对antidr5 mab相对敏感。bgc823对fasl敏感，对antidr5 mab相对敏感，表现为细胞死亡率与浓度升高不成比例。hela对fasl相对敏感，对antidr5 mab 敏感，表现为细胞死亡率与浓度升高成比例。肿瘤细胞株d6对fasl、antidr5 mab耐受，见表1。

　　2.2.2 fasl、antidr5 mab浓度为50 μg/ml时，细胞死亡率分别为71.78%±3.01%和54.95%±1.51%；1.562 5 μg/ml fasl、antidr5 mab对细胞杀伤率分别为0.99%±0.51%和9.41%±3.01%比较，差异显著（p＜0.01）。同剂量的fasl、antidr5 mab分别应用时组间差异明显（p＜0.01），只有在fasl、antidr5 mab浓度为25 μg/ml时，组间无差异（p＞0.05，图2a）。

　　同剂量的fasl、antidr5 mab单独应用于mcf7、bgc823、hela在高剂量时三组组间差异明显（p＜0.01），而3.125、6.25 μg/ml fasl/antidr5 mab组间差异不明显（p＜0.05）；fasl、antidr5 mab单独应用时各组间均有差异（p＜0.01，图2b、d、f）。

　　图1 rtpcr检测fas、dr5 mrna的表达（略）

　　fig.1 mrna expression of fas,dr5 was measured by rtpcr

　　note:fas located in 240 bp;dr5 located in 502 823;2.l342;;4.h9101;7;6.d6; marker.

　　表1 mtt法分析fasl、antidr5 mab(50 μg/ml) 对细胞生长的影响（略）

　　tab.1 mtt analysis of apoptotic cell dna multiplication after 50 μg/ml fasl/antidr5 mab

　　图2 fasl/antidr5 mab对h9101、mcf7、hela、bgc823、l342、d6的细胞毒效应（略）

　　fig.2 cytotoxic effects of fasl and antidr5 mab on h9101,mcf7,hela,bgc823,l342,d6

　　note:a.h9101;7;c.l342;823;e.d6; concentration from 1.562 550 μg/ml.

　　图3 fasl/antidr5 mab作用mcf7细胞后显微镜观察细胞形态改变（略）

　　fig.3 mcf7 cell was observed under optical microscope

　　note: cell;7 cell was cultured with 50 μg/ml fasl/antidr5 mab for 4 h.

　　图5 western blot检测细胞内caspase8、bcl2的表达（略）

　　fig.5 caspase8,bcl2 expression was analyzed by western blot

　　note:1.d6;;823;4.l342;7;6.h9101;e8;2.

　　图4 凝胶电泳检测fasl/antidr5 mab作用4小时后细胞的dna片段（略）

　　fig.4 cells were cultured with 50 μg/ml fasl/antidr5 mab for 4 h,the dna fragmentation was analyzed by agarose gel electrophoresis

　　note:1.l342+antidr5 mab;2.l342+fasl;3.h9101+antidr5 mab;4.h9101+fasl;823+antidr5 mab;823+fasl.

　　fasl、antidr5 mab单独应用于l342组间差异显著（p＜0.05），6.25 μg/ml fasl/antidr5 mab组间无差异（p＞0.05，图2c）。

　　fasl、antidr5 mab单独应用于d6组间无差异（p＞0.05，图2e）。

　　2.3 抗体杀伤肿瘤细胞的可能机制

　　2.3.1 fasl、antidr5 mab诱导肿瘤细胞凋亡的形态学改变 高剂量fasl、antidr5 mab作用mcf7细胞4小时后，显微镜观察细胞形态改变，细胞由正常的梭形、贴壁状态变为圆形、皱缩，并呈悬浮状态，见图3。

　　2.3.2 fasl、antidr5 mab诱导细胞凋亡dna断裂的定性检测 凋亡细胞dna电泳时也出现特征性的“梯状”带。高剂量antidr5 mab、fasl处理h9101组，细胞dna可见明显的梯状带；高剂量fasl处理l342、bgc823组可见梯状带，而高剂量antidr5 mab处理bgc823、l342组无明显梯状带，见图4。

　　2.4 影响细胞凋亡的可能因素 通过western blot检测肿瘤细胞内caspase8、bcl2的表达，结果6株肿瘤细胞在caspase8的55 kd区域可见明显的表达条带，其中l342、h9101条带明显，d6、bgc823、hela、mcf7次之；bcl2的26 kd区域只有mcf7、bgc823细胞出现表达条带，见图5。

　　3 讨论

　　antidr5 mab、fasl能不同程度地诱导6株肿瘤细胞凋亡，h9101、l342对fasl、antidr5 mab敏感；mcf7、bgc823对fasl敏感,对antidr5 mab相对敏感；hela对fasl相对敏感，对antidr5 mab敏感；肿瘤细胞株d6对fasl、antidr5 mab耐受。通过rtpcr检测fas/dr5 mrna水平的表达，发现6株肿瘤细胞中只有d6没有fas、dr5的表达，fasl、antidr5 mab诱导细胞凋亡的能力与细胞表面fas、dr5的表达有相关性，也说明了fas、dr5的表达差异是fasl、trail选择性诱导凋亡的关键点［5］。

　　对于细胞株h9101、l342，同剂量的antidr5 mab、fasl诱导其凋亡能力也存在显著差异（p＜0.01）。对于同种细胞由受体引发的下游凋亡通路是相同的并且参与此通路的凋亡因子及抗凋亡因子相同，区别应在于细胞膜表面dr5、fas的表达量存在差异，因而引发的下游级联反应强度不同。因此，可以认为antidr5 mab、fasl诱导同种细胞凋亡的活性与其受体表达有相关性。

　　狄冬梅等［6］将fasl基因通过腺病毒载体转染高表达fas、低水平表达fasl的肺腺癌细胞a549中,证实了fasl基因对a549肺腺癌细胞的生长抑制率可达84%,并且能显著地抑制其集落形成能力。shiraishi等［7］报道tunicamycin通过上调dr5的表达提高trail诱导人前列腺癌细胞pc3凋亡能力,这种增强作用可以被dr5/fc嵌合蛋白所阻断。horinaka等［8］通过实验首次揭示了luteolin通过dr5上调机制诱导人恶性肿瘤细胞凋亡，人重组dr5/fc抑制其凋亡作用，用sirna干扰抑制dr5的表达能有效地减少luteolin的凋亡作用。

　　实验通过western blot检测肿瘤细胞caspase8的表达时发现，正常状态下l342、h9101细胞中caspase8表达量较高，而mcf7、hela、d6、bgc823的表达量较低，6株细胞的敏感性也是这种趋势，这说明caspase8的表达与细胞对antidr5 mab/fasl敏感性相关。

　　通过western blot技术检测发现6个细胞系bcl2的表达情况不同，肿瘤细胞mcf7、bgc823有bcl2的表达，其他没有bcl2的表达。故认为bcl2在trail诱导的细胞凋亡中发挥抗凋亡作用。实验从另一方面证实bcl2与肿瘤细胞凋亡相关，与肿瘤细胞的敏感性相关。

　　综上所述，本文实验结果对6株肿瘤细胞对antidr5 mab/fasl敏感性与其死亡受体的表达、caspase8、bcl2的相关性提供了较有力的实验证据，对深入探索肿瘤细胞的耐药性的分子机制提供了新的信息与启示，并为凋亡诱导剂的改进提供研究基础。

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