人IL8正义和反义真核表达载体的构建与表达

【摘要】 目的: 构建人il8正义和反义真核表达载体。方法: rtpcr扩增正义和反义il8基因片段后, 将其克隆入真核表达载体pcdna3.1(+), 通过菌落pcr、 双酶切及测序进行鉴定后, 采用脂质体法分别瞬时转染至人卵巢癌细胞系a2780和skov3细胞中, 并用rtpcr和elisa法检测细胞转染后il8的表达水平。结果: 经验证, 重组人il8正义/反义真核表达载体构建正确。pcdna3.1(+)ssil8转染a2780细胞后, 其il8 mrna及蛋白表达水平均显著增加; 而pcdna3.1(+)asil8转染skov3细胞后, 其il8分泌水平降低。结论: 成功构建了人il8正义/反义真核表达质粒pcdna3.1(+)ssil8/pcdna3.1(+)asil8, 为后续研究il8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用打下基础。

【关键词】 il8; 正义/反义; 真核表达载体; 卵巢癌细胞

construction and expression of human il8 sense or antisense eukaryotic expression vectors

　　niu xiulong, wang yue△*, qu ye, guo xiaoqin, ye lu

　　department of immunology, medical college of chinese people’s armed police forces, tianjin 300162, china

　　[abstract] aim: to construct the sense or antisense il8 eukaryotic expression vectors. methods: sense or antisense il8 full length gene were amplified by rtpcr and cloned into eukaryotic expression vector pcdna3.1(+). after the identification by pcr, restriction endonuclease digestion and the nucleotide sequencing, the recombinant vectors were transfected into human ovarian carcinoma a2780 and skov3 cell lines transiently by lipofectamine mediation. the expression of il8 gene and protein were detected by rtpcr and elisa. results: the sense or antisense il8 eukaryotic expression vectors were constructed and verified. the expression of il8 gene and protein in a2780 cells transfected with pcdna3.1(+)ssil8 were increased, whereas the expression of il8 protein in skov3 cells transfected with pcdna3.1(+)asil8 was decreased. conclusion: the eukaryotic expression vectors pcdna3.1(+)ssil8 or pcdna3.1(+)asil8 have been constructed successfully, which lays a base for further study on roles of il8 in ovarian cancer and other tumors.

　　[keywords]il8; sense or antisense; eukaryotic expression vector; ovarian carcinoma cells

il8是一种多功能的趋化因子, 可参与多种恶性肿瘤的生长、 转移及血管生成。近年来研究表明[1, 2], il8在卵巢癌中高表达, 其高表达可能与卵巢癌发生、 发展及化疗关系密切。我们前期研究发现[3, 4], il8及雌、 雄激素均可促进卵巢癌细胞增殖; il8还可在无雌、 雄激素的条件下调节卵巢癌细胞表达雌、 雄激素的受体, 从而增加该细胞对两种激素的敏感性。为了深入探讨il8在卵巢癌发生、 发展及化疗和内分泌治疗中的作用及作用机制, 我们应用基因重组技术, 成功构建人il8正义(sense, ss)和反义(antisense, as)真核表达载体, 从而为后续研究il8在卵巢癌及其他肿瘤中的作用及作用机制奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 top10感受态细菌购自北京天根生物公司; 真核表达载体pcdna3.1(+)为美国invitrogen公司产品, 由本室保存。人卵巢癌细胞系a2780和skov3细胞均为美国atcc公司产品, 由本室保存。rpmi1640培养基为美国gibco公司产品; 2×premix taq、 mmlv逆转录酶、 bamhⅰ、 xhoⅰ为takara公司产品; t4 dna 连接酶为美国neb公司产品、 dna胶回收试剂盒为加拿大bio basic公司产品; 人il8 elisa试剂盒为美国r&d公司产品; optimemⅰ、 lipofectaminetm 2000、 trizol试剂为美国invitrogen公司产品; 100 bp和1 kb dna marker、 高纯度质粒小提试剂盒购自北京天根生物公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计 人il8全长编码基因扩增用引物, 参照genbank数据库(nm000584.2), 采用dnaman软件设计, sense il8引物, f: 5′ctcggatccatgacttccaagctggccgtg3′(划线部分为bamhⅰ酶切位点), r: 5′agactcgagttatgaattctcagccctctt3′(划线部分为xhoⅰ酶切位点); 目的片段318 bp。antisense il8引物, f: 5′ctcggatccatgtgaattctcagccctctt3′(划线部分为bamhⅰ酶切位点), r: 5′agactcgagttaacttccaagctggccgtg3′(划线部分为xhoⅰ酶切位点), 目的片段318 bp。

　　1.2.2 目的基因的扩增 自skov3细胞中提取总rna作为逆转录模板, 采用rtpcr方法扩增il8正义全长目的基因片段。逆转录反应条件参照takara mmlv逆转录酶说明书进行, 逆转录产生的cdna经pcr扩增获得约300 bp大小的目的片段(引物序列见1.2.1)。50 μl il8正义pcr产物经12 g/l琼脂糖凝胶电泳后, 按照dna胶回收试剂盒说明回收纯化dna片段。以此纯化的il8正义pcr产物为模板, 扩增il8反义全长目的基因片段(引物序列见1.2.1)。pcr反应体系: cdna 0.5 μl, 2×premix taq 25 μl, 上、 下游引物各25 pmol, 加双蒸水至总体积50 μl。pcr反应条件: 94℃ 5 min预变性; 94℃ 30 s变性, 59℃ 45 s退火, 72℃ 1 min延伸, 34个循环; 72℃ 延伸10 min。

　　1.2.3 重组质粒的构建 空载体pcdna3.1(+)、 il8正义或反义pcr纯化回收产物分别用bamhⅰ和xhoⅰ进行双酶切, 经电泳回收目的条带后定量。按照目的片段和载体片段摩尔比为3∶1的原则, 用t4 dna连接酶将双酶切后的目的片段和空载体进行连接, 而后转化入top10感受态细菌。将转化细菌均匀涂布于含氨苄青霉素50 mg/l的lb琼脂平板上, 倒置于37℃温箱培养12 h(过夜)。

　　1.2.4 重组质粒的鉴定 挑取孤立菌落, 用100 μl去离子水重悬, 作为模板, 进行菌落pcr扩增鉴定。pcr反应体系为: 菌落1 μl, 2×premix taq 10 μl, 上、 下游引物各10 pmol(引物序列见1.2.1), 加双蒸水至总体积20 μl。pcr反应条件同1.2.2。经菌落pcr鉴定阳性的单菌落, 接种于含氨苄青霉素100 mg/l的lb液体培养基中, 37℃恒温摇床震荡培养过夜, 按照质粒小量提取试剂盒说明提取质粒, 并用bamh ⅰ和xhoⅰ进行双酶切鉴定。经菌落pcr和酶切鉴定证实有插入片段后, 将阳性菌液2 ml送北京天根生物公司测序, 将测序结果正确的重组载体分别命名为pcdna3.1(+)ssil8和pcdna3.1(+)asil8。

　　1.2.5 细胞瞬时转染 采用脂质体法将重组载体pcdna3.1(+)ssil8或pcdna3.1(+)asil8及空载体pcdna3.1(+)分别导入a2780细胞和skov3细胞中。按照脂质体lipofectaminetm 2000说明书进行, 具体步骤如下: 用无抗生素、 含100 ml/l fbs的rpmi1640培养液调整细胞密度为2×108/l, 每孔2 ml加入6孔板, 37℃、 50 ml/l co2培养过夜。待细胞生长至80%融合时, 更换新鲜的无抗生素、 含100 ml/l fbs的rpmi1640培养液。准备a、 b两液, a液: 250 μl optimemⅰ, 加入4 μg重组载体或空载体, 轻混; b液: 250 μl optimemⅰ, 加入10 μl脂质体, 轻混后室温放置5 min。上述两液混合后, 室温放置20 min, 加入到每孔细胞中, 37℃、 50 ml/l co2培养6 h后, 更换无抗生素、 含100 ml/l fbs的rpmi1640培养液, 每孔2 ml。转染细胞分别命名为pcdna3.1(+)/a2780、 pcdna3.1(+)ssil8/a2780和pcdna3.1(+)/skov3、 pcdna3.1(+)asil8/skov3。

　　1.2.6 细胞转染后il8表达水平的检测 转染后24 h, 采用elisa法检测上清中il8的含量; 同时收集细胞, 抽提rna后分别以il8的特异性引物进行rtpcr反应。引物序列如下: il8, f: 5′aacatgacttccaagctggccg3′, r: 5′cagttttccttggggtccagac3′, 目的片段251 bp; 内参照gapdh, f: 5′ctcagacaccatggggaaggtga3′, r: 5′atgatcttgaggctgttgtcata3′, 目的片段450 bp。pcr反应体系: cdna 1.0 μl, 2×premix taq 10 μl, 上、 下游引物各10 pmol, 加双蒸水至总体积20 μl。pcr反应条件: 94℃ 5 min预变性; 94℃ 30 s变性, 59℃ 45 s退火, 72℃ 1 min延伸, 34个循环; 72℃ 延伸10 min。反应结束后, 取pcr反应液5 μl于12 g/l琼脂糖凝胶电泳。

　　2 结果

　　2.1 正义和反义il8全长基因片段扩增 以skov3细胞的总rna为模板, 应用前述引物进行rtpcr, 将扩增产物进行12 g/l琼脂糖凝胶电泳(图1), 可见300 bp左右单一条带, 与预计片段长度(318 bp)相符。

　　2.2 重组载体的构建与鉴定 目的片段和空载体分别经bamhⅰ和xhoⅰ双酶切, 按照目的片段与空载体的摩尔比为3∶1进行连接反应, 连接产物进行转化并过夜培养, 次日可见阳性菌落形成。挑选独立阳性菌落进行pcr扩增后, 可见约300 bp的条带(图2)。挑取pcr鉴定阳性的菌落摇菌, 提取质粒dna后进行bamhⅰ和xhoⅰ双酶切鉴定(图3), 可见约5.3 kb和300 bp左右的片段出现, 说明真核表达载体pcdna3.1(+)上已成功插入了ssil8或asil8全长编码基因。对阳性克隆中的插入片段进行序列测定, 结果显示, 所克隆的基因与genbank数据库中人il8的正义及反义全长序列完全一致。

　　2.3 rtpcr技术检测il8 mrna在a2780细胞中的表达 与对照a2780细胞和pcdna3.1(+)/a2780细胞相比(图4), pcdna3.1(+)ssil8/a2780细胞的il8 mrna的表达水平明显增高, 而未转染细胞和转染空载体细胞之间差别不大。

　　2.4 elisa法检测il8蛋白在a2780和skov3细胞中的表达 转染正义il8的pcdna3.1(+)ssil8/a2780细胞的il8 蛋白表达水平为(1.043±0.004)μg/l, 明显高于转染空载体的pcdna3.1(+)/a2780细胞(0.010±0.001)μg/l(p<0.01)(图5), 与rtpcr结果相符, 进一步证实il8的正义表达载体构建成功, 并能促进a2780细胞高表达il8。转染反义il8的pcdna3.1(+)asil8/skov3细胞的il8 蛋白表达水平为(0.835±0.003)μg/l, 低于转染空载体的pcdna3.1(+)/skov3细胞(0.969±0.001)μg/l(p<0.05), 证实il8的反义表达载体构建成功, 并能抑制skov3细胞表达il8。

　　3 讨论

　　il8是一种多功能的趋化性细胞因子, 有学者认为il8具有激活嗜中性粒细胞聚集到肿瘤局部, 对肿瘤细胞起杀伤和抑制作用; 而多数学者认为, il8能促进肿瘤的生长和转移, 其机制主要是通过作为自分泌生长因子、 血管发生因子和促进ⅳ型胶原酶的活性以及影响细胞的黏附移动, 从而促进肿瘤的发生、 发展和转移。il8在多数肿瘤组织中高表达, 而在其相应的正常组织却不表达或低表达[5]。研究表明, 卵巢癌患者高表达il8, 其腹水中表达水平明显高于血清[1]。应用免疫组化技术发现, 卵巢癌患者局部肿瘤组织中的il8高表达与肿瘤的进展程度及不良预后有关[2]。从卵巢癌细胞系heya8分离出的il8高分泌克隆 heya8(h)的增殖率明显高于低分泌克隆 heya8(l), il8可促进 heya8(l)克隆的增殖, 而il8的中和抗体可降低 heya8(h)克隆的增殖; 应用il8表达载体转染的heya8(l)克隆以增强il8的表达后, 可明显促进肿瘤细胞的增殖、 微血管密度以及后来的肿瘤形成[6]。il8还可封闭tnf相关凋亡诱导配体(tnfrelated apoptosisinducing ligand, trail)诱导的细胞死亡, 并且能使trail敏感的细胞系转变为trail抗性细胞系, 表明il8在保护卵巢癌细胞逃避trail介导的凋亡中起重要作用[7]。此外, il8表达可影响卵巢癌对化疗的敏感性。应用基因芯片技术分析发现, 紫杉醇耐药卵巢癌细胞的il8 mrna及蛋白表达均增加。penson等报道[1], 卵巢癌患者在紫杉醇治疗前给予甾体类抗雌激素治疗则血清中il8水平下降, 紫杉醇治疗后24 h 则其水平上升。这一结果与早期lee等人体外研究发现的紫杉醇可诱导人卵巢癌细胞的il8转录和分泌的结果相一致。目前有关il8诱导卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药的机制尚不十分清楚。

　　我们以往的研究证明人卵巢癌细胞系skov3可组成性高表达il8[5, 8], 而本研究证实, 另一种人卵巢癌细胞系a2780中的il8表达水平极低。提示这两种卵巢癌细胞可作为研究il8在卵巢癌中作用及作用机制的一个良好模型。本研究首先从高表达il8的skov3细胞中提取总rna并以此为模板, 根据人il8的全长编码区基因序列设计并合成ssil8和asil8两对引物, 通过rtpcr获得318 bp大小的目的片段即正义和反义il8全长编码基因, 并将其克隆入真核表达载体pcdna3.1(+)中, 由此构建了重组载体pcdna3.1(+)ssil8和pcdna3.1(+)asil8, 后经菌落pcr、 双酶切及核苷酸测序, 证实所获片段和目的片段序列完全一致。最后应用脂质体法将il8正义和反义表达载体分别导入低表达il8的a2780细胞和高表达il8的skov3细胞中, 并用rtpcr和elisa法检测细胞转染后il8的表达水平, 发现il8的表达量具有明显差异, 从而达到了预期的试验目的。总之, 人il8正义和反义真核表达载体的成功构建, 将为我们后续研究il8在卵巢癌发展及化疗、 内分泌治疗中的作用与作用机制奠定基础, 同时也为研究其他高表达il8的恶性肿瘤提供参考。

【参考文献】
　　[1] penson rt, kronish k, duan z, et al. cytokines il1beta, il2, il6, il8, mcp1, gmcsf and tnfalpha in patients with epithelial ovarian cancer and their relationship to treatment with paclitaxe[j]. int j gynecol cancer, 2000, 10(1): 33-41.

　　[2] merritt wm, lin yg, spannuth wa. effect of interleukin8 gene silencing with liposomeencapsulated small interfering rna on ovarian cancer cell growth[j]. j natl cancer inst, 2008, 100(5): 359-372.

　　[3] 王 越, 杨 洁, 高 燕, 等. il6、 il8上调卵巢癌细胞雄激素受体表达的作用分别依赖mapk途径和src活化[j]. 免疫学杂志, 2008, 24(4): 424-429.