人canstatin基因重组腺病毒载体的构建及其病毒制

【摘要】 目的： 利用hek293细胞内同源重组法构建带有绿色荧光蛋白报告基因的人血管能抑素（canstatin）重组腺病毒载体，扩增并纯化重组腺病毒颗粒. 方法： pcr法扩增canstatin全长基因，克隆至pgemt载体，经酶切和测序证实后，亚克隆到穿梭质粒pad5cmv中，获得穿梭质粒pad5cmv/canstatin. 用paci酶单独酶切穿梭质粒pad5cmv/canstatin和腺病毒e3区带有绿色荧光蛋白表达元件的腺病毒骨架载体，采用标准的磷酸钙方法共转染hek293细胞. 7~10 d后收获细胞裂解物，在hek293细胞中扩增，病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后，分光光度计检测重组病毒滴度. 结果： 测序证实pegmt/canstatin基因片段与genbank公布的canstatin基因序列一致. 重组腺病毒质粒转染293细胞后24 h观察到绿色荧光, 病毒纯化后制备出高滴度重组腺病毒(病毒滴度为2.0×1015pt/l). 结论： 成功构建了表达canstatin基因的重组腺病毒载体并制备了重组腺病毒颗粒，为研究该基因在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.

【关键词】 腺病毒载体；血管能抑素；绿色荧光蛋白质类

0引言

自folkman提出“肿瘤的生长和转移都依赖于新生血管的生成”概念以来，肿瘤的抗血管治疗一直受到人们的重视. 近年的研究［1-2］认为，通过上调抑血管生成因子表达或/和下调促血管形成因子的表达，均可抑制肿瘤血管的新生，从而达到抑制肿瘤生长的目的. 目前临床上已有数种抑制新生血管形成的药物用于抗肿瘤治疗，还有许多类似药物处于基础研究之中，并已显示出良好的应用前景［3-4］. 血管能抑素(canstatin)是继血管生成抑素(angiostatin)和内皮抑素(endostatin)之后，最新发现的来源于血管基底膜ⅳ型胶原的肿瘤血管生成抑制因子. 但利用腺病毒研究其抑制血管的研究报道国内外尚少见. 本研究克隆canstatin基因序列，并利用我们经过改良的腺病毒载体构建方法，构建表达canstatin基因的腺病毒载体，为进一步研究其抗肿瘤作用提供依据.

1材料和方法

1.1材料限制性内切酶：salⅰ，speⅰ，ecorⅰ，claⅰ，xhoⅰ，pacⅰ和t4连接酶(美国fermentas公司); taq dna聚合酶(大连takara公司); dna ladder marker(西安hybigen公司); iptg，xgal(上海sangon公司)；pgemt试剂盒(美国promega公司); 质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海axygen公司); 人cdna文库和宿主菌 dh10b由陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室保存；凝胶图像分析仪(上海复日科技公司); 高速离心机(美国beckman公司); 荧光显微镜及显微荧光摄影系统(德国zeiss公司). 引物序列: forward: 5′a atcgat atg gtc agc atc ggc tac ctc3′；backward: 5′a actagt tca cag gtt ctt cat gca cac3′. 引物合成和测序由上海生物工程有限公司完成.

1.2方法

1.2.1目的基因的克隆、测序pcr反应条件：94℃ 5 min, 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，72℃ 10 min，其中pcr 共30个循环. 取上述pcr产物20 μl在10 g/l琼脂糖凝胶上电泳，回收700 bp的目的基因. 回收产物以4∶1的比例连接入pgemt载体，22℃过夜. 转化 dh10b大肠杆菌，在amp+lb平板上37℃培养12~14 h，挑取阳性克隆，加入5 ml含amp的lb培养基中37℃摇菌16~18 h. 收集菌液并提取质粒，ecorⅰ酶切，电泳鉴定正确后，选一单克隆送公司测序，命名为pgemt/canstatin.

1.2.2 穿梭质粒载体的构建将pgemt/canstatin质粒dna 用claⅰ和speⅰ双酶切，连接到使用同样酶切的带有绿色荧光蛋白（egfp）荧光的穿梭质粒pad5cmv中，转化dh10b, amp+lb平板筛选、挑取阳性克隆、摇菌16~18 h后提取质粒，xhoⅰ和salⅰ酶切鉴定，构建成转移载体pad5cmv/canstatin. 酶切鉴定后，过柱法中提质粒，200 μl ddh2o溶解并定量.

1.2.3腺病毒的重组、扩增和滴度测定穿梭质粒载体pad5cmv/canstatin 经pacⅰ酶切使其线性化后，与同样用pacⅰ酶切的腺病毒骨架载体采用磷酸钙法共转染hek293细胞. 2 d后用荧光显微镜观察，7～10 d后收集细胞，离心沉淀后，在37℃和-80℃反复冻融3次，4℃, 2500 g离心10 min，收集病毒上清，再次使用上清感染hek293细胞以扩增重组病毒、氯化铯密度梯度离心纯化，分光光度计检测重组病毒含量.

2结果

2.1目的片段的克隆和鉴定pcr扩增产物在琼脂糖凝胶700 bp左右显示为1条带，与canstatin基因预计大小(含酶切位点)一致(图1). 纯化的pcr产物克隆到载体后经ecorⅰ酶切，琼脂糖电泳上可见1号，3号，6号克隆在780 bp处有一条带(图2). 阳性克隆的3号质粒dna经测序，得到的基因序列与已发表的人canstatin序列基本一致. 说明目的基因已成功克隆到pgemt easy载体中.

m：1.0 kb plus dna ladder marker；1：pcr扩增产物.

图1pcr扩增目的canstatin基因产物琼脂糖电泳

m：1.0 kb plus dna ladder marker；1～6：pgemt/canstatin阳性克隆ecorⅰ酶切产物.

图2克隆载体pgemt/canstatin的构建及酶切鉴定

2.2穿梭载体pad5cmv/canstatin的构建、鉴定和定量目的基因canstatin自载体pgemt/canstatin双酶切后亚克隆至pad5cmv载体中，形成pad5cmv/canstatin载体，经salⅰ和xhoⅰ双酶切鉴定，可见长度约1300 bp的插入片段（图3）. 鉴定正确的阳性克隆划amp+lb平板，过柱法中提质粒，分光光度计定量，结果为145.3 mg/l, a260 nm/a280 nm比值为1.87.

2.3重组腺病毒ad5/canstatin的构建及鉴定经pacⅰ线性化的padcmv/canstatin 质粒载体和骨架质粒载体共转染hek 293细胞. 2 d后荧光显微镜观察，大量细胞有egfp表达，7 d后可见感染细胞出现细胞病变效应 (图4).

2.4重组腺病毒ad5/canstatin 的扩增、纯化与定量ad5/canstatin病毒上清反复感染hek293细胞扩增病毒，经氯化铯离心纯化获得了病毒颗粒(图5). 经分光光度仪测定，病毒滴度为2.0×1015pt/l.

m：1.0 kb plus dna ladder；1～6：pad5cmv/canstatin(xhoⅰ和claⅰ酶切).

图3pad5cmv/canstatin克隆载体的酶切鉴定

图4质粒共转染hek293细胞7 d后出现的细胞病变效应×100

图5ad5/canstatin病毒颗粒经氯化铯密度梯度离心纯化后照片

3讨论

canstatin蛋白是来源于人类基底膜组织中的ⅳ型胶原α2链的非胶原1区的结构域（nc1），mr约为24×103，由228个氨基酸组成. 有研究［3］报道，该基因具有抑制肿瘤的作用，并根据癌症（cancer）和停滞（stasis）二者的名字而命名为canstatin. 体外实验表明，重组鼠的canstatin具有抑制血管形成和抑制内皮细胞的增生作用［4］. 本研究扩增得到人的canstatin基因片段，经测序所得到的基因序列与文献报道的人canstatin序列相比基本一致. 但不同之处是第267位的cta和第330位gaa均突变为g，但编码的氨基酸未发生变化，分别为leu和glu，属于沉默突变型.

近年来，腺病毒载体已成为基因治疗的热点. 相比而言有以下优点：载体制备滴度高、宿主范围广、插入突变率低、插入外源基因片段大、体外稳定、易于制备与纯化等. 因此，腺病毒载体在细胞信号转导、基因表达调控和基因治疗的研究中受到人们的青睐，已成为当今被广泛使用的病毒载体之一［5-6］. 目前，制备腺病毒载体所使用的同源重组方法主要分为在真核细胞中重组及在细菌中同源重组两种. 我们采用在真核细胞hek293中，将穿梭载体与病毒骨架载体经pacⅰ酶切线性化后共转染hek293细胞［7-8］. 许多研究者采用的方法是将腺病毒穿梭质粒和环状的骨架质粒padeasy1共转化大肠杆菌 bj5183，重组成功的质粒用 pacⅰ酶切线性化，然后用磷酸钙法转染包装细胞 hek293细胞［9-11］. 本研究方法直接采用线性化的穿梭质粒和骨架质粒共转染hek293细胞，与在细菌中同源重组的方法比较，该方法较快速、简便，避免了在细菌中同源重组繁琐的筛选过程. 其不同点是，我们将egfp表达元件设计在病毒载体骨架中的e3区［8］，便于病毒制备过程细胞病变效应的观察及扩增病毒过程中的病毒感染效果的判断.

综上所述，利用本实验室构建腺病毒的方法，成功构建了表达canstatin基因并在 293 细胞中包装获得重组腺病毒ad/canstatin，为研究其在肿瘤治疗中的作用奠定了基础.

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