荧光定量PCR检测女性HPV-DNA的临床价值

摘    要：目的：评价荧光定量PCR技术在女性生殖道人乳头状瘤病毒（HPV-DNA）中的检测价值。方法：收集2016年10月-2021年5月体检中心26 630例健康体检者、门诊12 521例及住院患者5 576例的宫颈分泌物，采用PCR荧光探针法进行HPV-DNA检测，对检测结果进行统计分析。结果：门诊患者与住院患者HPV感染率均高于健康体检者，差异有统计学意义（P<0.05）。健康体检者、门诊及住院患者荧光定量PCR法检出HPV感染7 860例，阳性率为17.57%；其中高危型2 542例（32.34%）、低危型5 318例（67.66%）；与病理活检结果比较，荧光定量PCR法检测高危型HPV阳性符合率为93.30%，阴性符合率为93.59%，总符合率为93.55%。结论：荧光定量PCR法是HPV-DNA有效的临床检测技术，在检测常见的高危型HPV方面有较好结果，可用于女性大规模体检初筛。
关键词：荧光定量PCR技术 人乳头状瘤病毒 宫颈肿瘤

宫颈癌为女性常见、多发恶性肿瘤，也是致女性死亡的主要疾病。尤其是近年来，宫颈癌在临床发病特点上又出现了一些新的变化，表现为患病者年龄呈年轻化、发病率不断增高[1]。因宫颈癌有较长的可逆性癌前病变期，因此，早发现、早治疗可以在很大程度上延长其存活时间，这也是临床重视并强调宫颈癌筛查与预防的出发点，通过有效筛查、降低宫颈癌发病率和致死率。人乳头状瘤病毒(HPV)是一种DNA肿瘤病毒，HPV感染是造成皮肤、黏膜良性或恶性病变的主要因素，很多肿瘤均与HPV感染相关[2]。随着临床对宫颈癌研究的深入，发现HPV感染与宫颈肿瘤之间也有密切关联。对HPV的检测，以往临床采用血清学检测方法、巴氏涂片、体外病毒培养基液基薄层细胞技术等方法，在一定程度上有操作复杂、主观性较大的缺点，使结果缺乏准确度，给HPV临床诊断和治疗造成一定影响。实时荧光定量PCR方法可以直接测定HPV的DNA，能够灵敏、快速地检出HPV的存在，是检测HPV的理想方法[3]。本研究采用荧光定量PCR技术对女性宫颈分泌物标本感染HPV的情况进行研究，评价该技术的临床应用价值，以期为大规模展开女性HPV-DNA筛查、预防宫颈癌发生提供参考。

资料与方法

搜集2016年10月-2021年5月敦煌市医院来自体检中心26 630例、门诊12 521例、住院患者5 576例研究对象的宫颈分泌物，总计44 727例；年龄18～57岁，平均年龄(37.5±19.5)岁。
方法：⑴仪器和试剂：全自动医用PCR分析仪(SLAN-96P)；检测试剂盒由圣湘生物科技股份有限公司提供。⑵标本采集：采集标本时，先用窥阴器/阴道张开器辅助宫颈暴露，用棉拭子把宫颈口位置过多的分泌物擦掉，宫颈刷放在宫颈口的位置，单方向转5圈，再把宫颈刷头部放入洗脱管，沿刷柄折痕位置折断宫颈刷柄，之后将洗脱管盖旋紧，送检。不能马上送检时，应放置在-20℃的环境下保存，并于7 d内完成检测。⑶检测方法：采用PCR荧光探针法检测：(1)DNA提取：洗脱宫颈刷，将洗脱液放入1.5 m L离心管，13 000 r/min，离心10 min，弃上清液，取50 m L裂解液加入其中悬浮、沉淀，使用沸水浴的方法加热10 min后，13 000 r/min，离心10 min，取上清液备用。(2)PCR扩增：严格按照说明书要求设置扩增参数，取20μL反应液加到5μL已经提取的待测样本DNA中，进行杂交与显色。(3)结果判读：结合膜条上蓝色斑点显现位置，对相应位置标记的基因型信息进行读取，只有1个基因型位点有蓝色斑点，表示相应基因型单一感染，多个基因型位点有蓝色斑点，表示相应基因型的混合感染；阴性质控品杂交膜条除了在IC位点有蓝色斑点，其他部位均无显色，阳性质控品必须保证在相应HPV基因型位点和IC位点有显色。⑷宫颈病变诊断：采用荧光定量PCR技术检测宫颈分泌物中HPV的起始病毒量，认为PCR结果拷贝数高于最低检测值，即50拷贝/m L者，为可疑阳性标本[4]。根据检测基因型将致病性分为高危型、低危型，高危型如HPV16、18、31、33、35等，低危型如HPV6、11、42、43等。⑸宫颈病理活检：对检测到上皮内病变的患者进行病理学检查，用活检钳取几小块组织，放于10%甲醛溶液中固定，送至病理科做切片，染色后于显微镜下观察、分析，得到病理诊断。(1)炎性与良性病变，如宫颈炎、宫颈肥大、息肉等；(2)宫颈上皮内瘤变(CIN)，有CINⅠ(轻度)、CINⅡ(中度)、CINⅢ(重度)；(3)浸润性宫颈癌。
观察指标：(1)比较门诊、住院患者与健康体检者HPV感染率；(2)统计荧光定量PCR法对高危HPV的检出率；(3)比较荧光定量PCR法检测高危型HPV结果与病理活检的符合率。
统计学处理：数据应用SPSS 25.0软件处理；计数资料以[n(%)]表示，采用χ2检验；计量资料以(±s)表示，采用t检验；P<0.05为差异有统计学意义。

结果

门诊、住院患者与健康体检者HPV感染率比较：门诊12 521例患者中，检测HPV感染3 005例(24.00%)，其中多重感染876例(7.00%)；住院患者5 576例中，检测HPV感染1 394例(25.00%)，其中多重感染390例(6.99%)；体检中心26 630例健康者中，检测HPV感染3 461例(13.00%)，其中多重感染798例(3.00%)。门诊与住院患者HPV感染率高于健康体检者，差异有统计学意义(P<0.05)。
荧光定量PCR法检测高危HPV:44 727例研究对象中，荧光定量PCR法检出HPV感染7 860例，阳性率为17.57%；其中高危型2 542例(32.34%)、低危型5 318例(67.66%)。
荧光定量PCR法检测高危型HPV结果与病理活检的符合率：荧光定量PCR法检测高危型HPV阳性符合率为93.30%(362/388)，阴性符合率为93.59%(2 016/2 154)，总符合率为93.55%(2 378/2 542)。见表1。
表1 荧光定量PCR法检测高危型HPV结果与病理活检的符合率

讨论

目前已经发现的HPV亚型有百种之多，其中40多种常见HPV会造成女性生殖道感染，且高危型HPV的持续感染更是增加了宫颈癌发生的概率[5]。近年来，宫颈癌在全球的发生率均有所增加，是威胁广大女性生命安全的主要恶性肿瘤，对于本病的预防及治疗越来越重要，及早发现、及早预防和治疗对宫颈癌预后改善有重要作用。HPV感染作为宫颈癌发生的重要诱因，HPV检测已经被临床认为是预防肿瘤发生、控制肿瘤发展的重要方法。目前在很多医院的妇产科已经设立了高危型HPV检查，对女性宫颈组织行HPV-DNA检测可有效且及时地监控宫颈癌与癌前病变的发生、发展。通过采用荧光定量PCR检测HPV-DNA，不仅简单、易掌握，而且成本较低，医务工作者经过一段时间的学习和培训便可实践应用，普及性强。因此，采用荧光定量PCR检测HPV-DNA已经成为很多地区筛查宫颈癌的主要手段。
HPV感染之后使用传统的病毒培养方法与血清学检测难以及早发现，特别是女性性接触传播疾病患者的生殖道混合感染、宫颈糜烂等存在着HPV潜伏性感染。对于没有直观皮损或者是亚临床感染者，HPV能够通过寄生在受损宫颈上皮，使宫颈发生持续感染，再历经8～10年的时间，宫颈上皮便会发生不典型增生，导致发生程度各异的癌前病变，最终致癌变发生。随着医学实验技术的发展，HPV感染检查方法有了很大进步，其中荧光定量PCR技术是目前最常用也是非常灵敏的检测方法，该技术简单易行，将普通PCR的高灵敏性、DNA杂交的高特异性以及光谱技术的高准确性有机结合，突出特异性强、灵敏度好、定量准确、速度快以及重复性好等诸多优点。较细胞学检查，采用PCR检测HPV-DNA的敏感度更高，其原因可能与信号放大作用有关。本研究中，采用PCR荧光探针定量检测，从搜集到的体检中心26 630例，门诊12 521例，住院患者5 576例，总计44 727人中，检测HPV阳性率为17.57%。通过对检测到上皮内病变的患者进行病理学检查，比较发现荧光定量PCR法检测高危型HPV阳性符合率为93.30%，阴性符合率为93.59%，总符合率为93.55%，检出率均较高。荧光探针PCR法能够检测14种常见的高危型HPV-DNA型，如HPV16、18、31、33、35等，大多数与宫颈癌有密切相关性。提示该检测方法在女性HPV-DNA筛查中有重要作用[6]。高危型HPV作为与宫颈癌病发有密切关系的因素，通过荧光定量PCR检测HPV，于PCR的基础上再结合荧光探针，使用核酸扩增检测试剂进行基因扩增反应，把HPV分型，从而实现对HPV早期、高效、简单的检测。在亚临床患者当中发现高危型阳性病例，继而有效管控癌前病变，通过定期随访，对发病者及时治疗，预防宫颈癌的发生，最大程度上避免宫颈癌的发展与扩散。
同时，荧光探针PCR法还有操作简单、检测快速且成本较低的优势，这些也决定了其适用于大规模人群的体检初筛[7]。但是应注意，对于一些低危型HPV感染引起的疾病检测，荧光探针PCR法尚有不足之处，可结合其他筛查手段进一步得到筛查结果[8]。
综上所述，荧光定量CPR法是HPV-DNA有效的临床检测技术，在检测常见的高危型HPV方面有较好结果，可用于女性大规模体检初筛。

参考文献
[1]程跃建.HPV-DNA实时荧光定量PCR检测与宫颈癌相关性研究[J].检验医学与临床,2018,15(24):3718-3720.
[2]王景芬.实时荧光定量PCR在HPV检测中的应用研究[J].中西医结合心血管病电子杂志,2018,6(22):187.
[3]袁媛,黄赫.实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒HPV23分型的临床研究[J].海峡药学,2016,28(7):3.
[4]王飞霞,杨瑞利,韩双.细胞DNA定量分析联合HR-HPV、SCCA、CYFRA21-1检测在早期宫颈癌筛查中的价值[J].肿瘤学杂志,2018,24(3):281-284.
[5]汤海华,区佩雯.HPV-DNA结合TCT检查筛查宫颈癌的临床意义[J].医学食疗与健康,2020,18(14):191-192.
[6]樊晓阳.实时荧光定量PCR在高危型HPV感染检测中的应用价值[J].河南医学研究,2020,29(20):3808-3810.
[7]黄晓叶.实时荧光定量多聚核苷酸链式反应在高危型人乳头瘤病毒诊断中的应用价值[J].医疗装备,2021,34(8):31-32.
[8]孟凡杰,童文珍,王健,等.流式细胞术联合荧光定量PCR精确检测HPV病毒载量在宫颈病变诊治中的应用研究[J].医学检验与临床,2019,30(4):1-3.

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