提高不合格羊水标本细胞培养成功率的探讨

摘　要：目的：探讨提高血性羊水等不合格羊水标本培养成功率的方法。方法：采用多次换液或传代方法改善培养内环境来确定合适的时间收获羊水细胞。结果：32例不合格标本中，成功25例，成功率为78%。结论：采用适当的措施可以提高对不合格羊水标本培养成功率。

关键词：羊水细胞培养；染色体核型；产前诊断
    羊水细胞培养及染色体制备是诊断染色体病的主要手段^[1]。羊水细胞培养一般存在技术要求高、周期长、易污染和分裂相少等问题，一旦接受的羊水标本出现血性羊水、胎脂、胎粪、离心后沉淀物过少和生长不良羊水标本时，需要采取与常规培养不同的处理手段以降低这些不利因素对培养的影响^[2]。现将32例不合格标本培养处理结果报告如下。

1 资料与方法

1.1  一般资料：2009年3月～2011年12月32例经产前筛查，年龄23～42岁，孕周18～24周，在孕妇知情同意后实施羊膜腔穿刺技术。

1.2  方法

1.2.1 羊水采集方法：取20 ml一次性注射器，B超引导定位，在无菌条件下，采用7号腰穿针穿刺。用20 ml注射器抽取15 ml羊水，把羊水分装入2个一次性无菌15 ml离心管中，直接送检。

1.2.2 羊水细胞培养：以1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，保留约0.5 ml沉淀，血性、胎粪、胎脂类羊水需在沉淀中加入2 ml培养液，平均分配到4个培养瓶中，每瓶加入5 ml培养液，置5% CO₂培养箱。培养7 d后，取出培养瓶，在超净台中，倾斜培养瓶，用一次性消毒的巴氏吸管将培养液吸去，加入5 ml新鲜培养液，倒置镜下观察，如能看见小的羊水成纤维细胞的集落，则继续培养3～4 d，根据羊水细胞的生长状况进行收获。如在倒置镜下不能清楚观察，则在第2天，在超净台中摇动培养瓶，将血细胞摇浮在培养液中，用一次性消毒的巴氏吸管吸去2～3 ml培养液（每2瓶吸出的培养液放置在1个新的培养瓶中培养），同时添加2～3 ml培养液于原培养瓶中，在倒置镜下观察细胞贴壁的情况。此时一般均能看清细胞的贴壁情况。

离心后沉淀物过少的标本，将沉淀物放置两个培养瓶中培养，两个培养瓶分别放在两个培养箱中。6～7 d观察细胞贴壁的情况。生长不良的羊水细胞，通常只有一个小集落，多数成长梭形成纤维细胞，一般少见圆形羊水细胞，待其集落生长到较大规模，集落周边也出现十多个类羊水细胞时，用记号笔在培养瓶底部做好记号，在超净台用一次性消毒的巴氏吸管反复抽吸培养瓶中的培养液，冲击记号处的集落5～6次后换一个一次性消毒的巴氏吸管吸取2 ml培养液置另一个培养瓶中传代，补齐各培养瓶的培养液至5 ml，放入培养箱中培养3 d后，再在倒置镜下观察直到获得一定的羊水细胞为止。

1.2.3 羊水细胞的收获：弃去培养瓶内的上清液，加入1%柠檬酸三钠溶液，37℃培养箱低渗50 min，然后拧紧瓶盖甩动培养瓶2 min，培养瓶中的集落细胞会掉落在低渗液中，把它倒入刻度离心管，然后用固定液（甲醇:冰乙酸=3:1）3 ml洗脱培养瓶，将洗脱后固定液倒入已盛有集落细胞的低渗液刻度离心管中混匀，进行预固定。离心10 min，弃上清，保留沉淀，再加入6 ml固定液，固定20 min，重复固定2次，滴片制片显带按常规分析。

2 结果

32例不合格标本，25例培养成功，获得足够分裂相，7例失败，均非细菌污染导致的失败，而是不能收获到足够的分裂相。25例成功的羊水细胞培养中，24例核型正常，1例46，XX，+t（21，22）。见图1～2。

图1  收获前羊水细胞

图2  羊水染色体分裂相

3 讨论

行羊膜腔穿刺后获得羊水细胞作产前诊断是目前广泛应用的技术，但这项技术存在一定风险，可造成孕妇和胎儿的损伤、感染或流产发生率。羊水细胞主要来源于胎儿皮肤、消化、呼吸道等脱落细胞，脱落细胞中活性细胞数量较少，而且培养周期长，影响因素多，往往一次培养失败就会使孕妇失去羊水采取的最绝对时机，尤其羊水标本的质量对整个实验室是至关重要的。但因为该技术固有缺陷，一些不合格的标本难以避免，这些标本主要是由于混入了胎脂、胎粪、大量的血液和所采集到的活性细胞过少等。羊水培养失败的主要原因就是细胞集落过早地老化或成纤维细胞过多，传代后集落细胞变性，形成巨长梭形细胞，使得收获时不能得到足够的分裂相，而血细胞、血液中的某些成分以及胎脂、胎粪等都是引发细胞集落过早老化的原因之一。为了提高培养的成功率，避免孕妇进行二次穿刺，我们在实践中摸索出一系列的方法，提高这部分标本的成功率，取得了较满意的效果。

将羊水分置于4个培养瓶中，这样能有效地降低血液、胎脂和胎粪的浓度，改善羊水细胞的生长环境，有利于羊水细胞贴壁。

培养7 d时，因红细胞等的遮盖不能观察到羊水细胞贴壁情况，此时将培养瓶的培养液全部置换，可移去绝大多数的血液、胎脂和胎粪，次日再次换液，并将上清液进行传代培养。以避免因摇动而脱落的羊水细胞被丢弃。

将培养瓶置不同的培养箱，培养系统会因温控失灵、室温过高或过低等原因发生温度和二氧化碳浓度的漂移，而影响细胞的生长和贴壁，这样可避免培养系统发生故障而“全军覆没”。

对培养物进行传代，标本中羊水细胞过少时，将形成的小集落打散后，吸出一部分置另一培养瓶中培养，既让细胞在原瓶中分散生长，同时也有利于羊水细胞在传代瓶中生长。

使用柠檬酸三钠松懈，细胞培养完成后需要使细胞松懈后才能滴片，过去所使用的细胞刮刀和胰酶消化会造成分裂相的大量丢失，我们采用1%柠檬酸三钠长时间的低渗作用，并摇动培养瓶，使细胞集落松懈，有效地保存了大量的中期羊水细胞的分裂相，提高了成功率。

经采取以上这些措施后，32例不合格羊水标本培养成功25例。成功率达到78.12%，有了显著的提高，取得了较为满意的效果。

4 参考文献

[1] 孙明强,许继秀.提高羊水细胞培养成功率的方法[J].中国优生与遗传杂志,2007,15(6):45.

[2] 窦  蓉,朱祖华.羊水绒毛染色体检查在胎儿产前诊断中的临床应用[J].中国优生与遗传杂志,2005,13(4):38. 本文链接：http://www.qk112.com/lwfw/yxlw/linchuangyixue/96562.html