板蓝根美拉德反应对MDCK细胞保护作用的相关分析

现代药理学研究表明，板蓝根具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤以及增强免疫力等作用，被广泛应用于治疗诸如流感、发热、乙肝、腮腺炎等疾病，临床疗效确切。然而中药区别于其他药物的显著特点是其药效与炮制、制剂过程密切相关，中药汤剂中黑褐色物质是其在炮制、煎煮等热加工过程中产生的美拉德反应产物（Maillard Reaction Products，MRPs），是不同种类的中药在这些加工过程中最主要的、共同新生物质。韩立坤等确认红参炮制过程中发生了美拉德反应，李向高等测定精氨酸双糖甙含量在红参中比生晒参高3倍，并据此提出控制美拉德反应条件对提高红参加工质量有重要意义。本研究旨在确证板蓝根在不同加工条件下的美拉德反应对其体外抗病毒作用的影响，并分析其可能的作用机理，亦为中药热加工过程产生的MRPs是中药汤剂中的重要药效成份的假说提供有力的证据。
　　1 资料与方法
　　1.1一般资料流感病毒（H1N1亚甲型病毒）由第四军医大学微生物教研室提供；狗肾上皮细胞（MDCK）由兰州军区总院实验中心保存；板蓝根采购于甘肃省定西市板蓝根GAP生产基地。
　　MEM培养基购自GIBCO公司；小牛血清购自HyClone公司；MTT购自美国AMRESCO公司。
　　1.2方法
　　1.2.1实验用板蓝根提取液的制备鲜根提取液和生药提取液的制备：分别称取粉碎后板蓝根鲜根和生药各35g，于100mL 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中充分浸润，并于4℃搅拌浸提过夜，然后21400g离心15min，收集上清液，即为鲜根样品和生药样品提取液；板蓝根孵育样品的制备：各称取板蓝根生药50g于60℃，85%湿度下孵育2d与7d（下文简称2nd、7th），加入8倍量水，沸水煎煮2次，第1次2h，第2次1h，过滤并合并煎液，21400g离心15min，取上清液定容至155mL，即为2nd、7th样品提取液。
　　1.2.2 实验操作将MDCK细胞用胰酶消化并混匀，稀释至2.5×105个细胞/mL，于96孔细胞培养板中加200μL/孔细胞悬液，培养24h至MDCK细胞铺满孔底，用无菌PBS洗掉细胞表面的小牛血清蛋白。将稀释好的各浓度样品加于已长满单层细胞的96孔板内，每浓度4孔，200μL/孔，37℃ 3h后弃样品液，加100 TCID50病毒液100μL，同时各加100μL的细胞维持液，37℃培养 2h后弃病毒液，加细胞维持液200μL，于37℃、5%CO2 培养。72h后用MTT法于570nm处测OD值。保护率计算公式为：保护率%=（OD570样品组- OD570病毒组/OD570对照组- OD570病毒组）×100%。
　　2结果
　　2.1板蓝根鲜根对MDCK细胞保护实验板蓝根鲜根提取液通过保护细胞而起到抗病毒效果的结果如图1所示，不同浓度鲜根提取液细胞组存活率均低于病毒对照组，说明鲜根提取液与细胞作用后，对病毒侵染MDCK细胞不仅没有保护作用，反而表现出一定程度的毒害作用，但各浓度对MDCK细胞毒害的差异不明显。
　　
　　图1板蓝根鲜根提取液对MDCK的保护作用
　　
　　2.2板蓝根生药对MDCK细胞保护实验板蓝根生药提取液对MDCK细胞保护实验结果见图2。当生药浓度为20mg干物质/mL时，其对MDCK细胞的保护率为5.7%。当低于此浓度时，其对细胞不但没有保护作用，反而有一定的毒害作用，但各浓度对MDCK细胞毒害作用差异不显著。
　图2板蓝根生药对MDCK细胞的保护作用
　　
　　2.3板蓝根2nd样品对MDCK细胞保护实验板蓝根2nd提取液对MDCK细胞的保护实验结果见图3。各浓度2nd样品与鲜根提取液一样，对MDCK细胞均没有保护效果。在病毒侵染细胞情况下，甚至表现出不同程度的毒性作用，样品浓度越稀，其对细胞的毒害作用越大，但最后亦趋于稳定。
　　
　　 图3板蓝根2nd样品对MDCK细胞的保护作用
　　
　　2.4板蓝根7th样品对MDCK细胞保护实验板蓝根7th提取液通过保护细胞而起到抗病毒效果的结果见图4。由图可知，7th样品提取液对MDCK细胞有较好的保护效果。当样品浓度为31.5mg干物质/mL时，其对MDCK细胞的保护率为40.76%，说明7th样品在适当浓度下，可阻拦病毒侵染细胞。随着样品浓度的降低，其对细胞的保护效果逐渐减弱，说明随着样品稀释倍数的增大，7th样品中可保护细胞的有效成分减少，对细胞的保护效果亦下降。
　　
　　 图4板蓝根7th样品对MDCK细胞的保护作用
　　3讨论
　　药物体外对抗流感病毒受多种因素的影响，如样品的处理和加工、质量、产地、浓度等。本实验通过不同处理的板蓝根样品对MDCK细胞的保护作用来考察鲜根、生药、2nd、7th样品的抗病毒效果。实验中先加板蓝根各样品提取液后接种病毒的目的是为了观察板蓝根样品能否进入细胞或者吸附于细胞表面以阻止病毒的吸附和进入。
　　实验结果显示，7th样品对MDCK细胞受流感病毒侵染有显著的保护作用，而鲜根、生药、2nd对流感病毒侵染无明显阻断作用，且其在一定浓度范围内对细胞表现出毒害作用。说明7th样品中的MRPs可与细胞膜结合，竞争性抑制了病毒血凝素HA与MDCK细胞膜唾液酸受体的结合，或是样品中MRPs与膜的结合使得HA结合位点附近的空间结构发生变化，使其空间位阻增大，从而保护了MDCK细胞受病毒的侵染。
　　实验样品同为板蓝根，却对病毒表现出不同的阻断效果，究其原因，可能是因为板蓝根不同加工方式使得美拉德反应产生MRPs量及种类不同。因此，板蓝根样品对病毒是否有阻断作用，一方面可能取决于样品加工过程中产生MRPs的量和种类，另一方面可能与板蓝根样品加工处理得当与否相关。本实验结论对改善板蓝根加工炮制方法具有一定的参考意义。
　　参考文献：
　　程妍，李祥，陈建伟,等．板蓝根有效部位的抗病毒药效研究．南京中医药大学学报，2011，27（2）：155-157.
　　高欣，董堞瑾，金鑫，等． 板蓝根抗炎活性部位筛选的初步研究． 武警医学院学报，2010，19( 9) :709．
　　付莉，李铁刚. 简述美拉德反应. 食品科技,2006,12:9-11．
　　rria, , Albarz. Melanoidins Formed by Maillard Reaction in Food and Their Biological Activity. Food Engineering Reviews,2012,Vol.4(4):203-223.
　　韩立坤，郑毅男，胡国宣，等．红参加工中的梅拉德反应．吉林农业大学学报，1994，16(增刊)：68-71．
　　李向高，郑毅男，刘墨祥，等．红参加工中美拉德反应及其产物的研究．中国中药杂志，1999，24(5)：274-279．
　　Zhanmei Jiang , Dilip K. Rai ,Paula M. O'Connor , et al. Heat-induced Maillard reaction of the tripeptide IPP and ribose: Structural characterization and implication on bioactivity．Food Research International, 2013, Vol.50 (1).