延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌细胞膜L型Ca2

作者：李荣，吴伟，吴辉，王嵩，刘煜德，于扬文，陈宇鹏，李俊哲

【摘要】 【目的】观察延胡索碱预处理对缺血再灌注心肌细胞膜l型ca2+通道动力学的影响，并探讨其防治再灌注损伤的作用机制。【方法】将清洁级成年sd大鼠48只随机分为6组：延胡索碱高、中、低剂量预处理组(剂量分别为10、05、02g·kg-1·d-1)，缺血预处理组，模型组和假手术组，结扎左冠状动脉前降支近段30min后再灌注60min，之后断头放血取心脏。采用酶解技术分离大鼠心室肌细胞，应用膜片钳细胞吸附式单通道电流记录与分析方法，观察记录心肌细胞膜l型ca2+通道平均开放概率、平均开放时间及平均电流幅值。【结果】与模型组比较，缺血预处理组和延胡索碱预处理各组心肌细胞l型ca2+通道平均开放概率显著降低(均p<001)，但平均开放时间比较差异无显著性意义(均p>005);与缺血预处理组比较，延胡索碱预处理中、低剂量组可降低l型ca2+通道电流幅值(p<005)。【结论】延胡索碱预处理防治再灌注损伤的可能作用机制与其能减少心肌细胞膜上l型ca2+通道的开放概率，降低钙内向电流，避免细胞内钙超载，从而保护心肌细胞有关。

【关键词】 心肌缺血/中药疗法;延胡索碱/药理学;l型ca2+通道;疾病模型，动物;大鼠

　心肌缺血再灌注是一种复杂的病理生理过程，研究表明[1]氧自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、血管内皮细胞、一氧化氮、中性粒细胞和细胞凋亡等因素均可能参与心肌缺血再灌注损伤的发病过程。本研究采用酶解技术分离大鼠心室肌细胞，应用膜片钳细胞吸附式单通道电流记录方法，观察缺血再灌注损伤心肌细胞膜l型ca2+通道的平均开放概率、平均开放时间及平均电流幅值的变化，初步探讨延胡索碱预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用和机制，现报道如下。

　　1材料与方法

　　11实验动物

　　清洁级(spf级)成年sd大鼠48只，雌雄各半，体质量(250±10)g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证：scxk粤20030001。

　　12主要试剂及仪器

　　ⅰ型胶原酶、牛血清白蛋白(bsa)、4羟乙基哌嗪丙磺酸(hepps)、乙二醇二乙醚二胺四乙酸(egta)均购自sigma公司，其他均为国产分析纯;延胡索碱(含生药2g/ml的总生物碱，由广州中医药大学第一附属医院制剂室监制)。dh150动物人工呼吸机 (浙江大学医学仪器厂)，ms2000生物信号记录分析系统(广州龙飞达科技有限公司)，bl2000图像分析系统(成都泰盟科技有限公司)，langendorff灌流系统，olympus倒置显微镜(japan)，mp285三维操作系统(sutter，usa)，p97微电极拉制仪(sutter，usa)，epc9膜片钳放大系统(heka，germany)，数据采集和信号分析处理软件(pulse & pulsefit，heka，germany)，单通道电流分析处理软件tac与tacfit(bruxton，usa)。

　　13液体配制

　　无钙台式液：143mmol/lnacl、54mmol/lkcl、03mmol/lna2hpo4、5mmol/lhepps、05mmol/lmgcl2、5mmol/lglucose，用2mol/lnaoh调ph值至72~74。高钾溶液：70mmol/llglutamicacid、25mmol/lkcl、20mmol/ltaurine、10mmol/lkh2po4、3mmol/lmgcl2、10mmol/lglucose、10mmol/lhepps、05mmol/legta，用2mol/lkoh调ph值至72~74。记录l型ca2+通道的电极内液为110mmol/lbacl2、10mmol/lhepps，用2mol/lba(oh)2调ph值至72~74。记录l型ca2+通道的电极外液为140mmol/l天门冬酸钾、10mmol/legta、10mmol/lhepps、5mmol/lglucose、0001mmol/l河豚毒素(ttx)，用2mol/lkoh调ph值至72～74。

　　14动物分组与给药

　　选用sd大鼠48只，随机分为6组：延胡索碱高、中、低剂量预处理组(中药高、中、低剂量组)，缺血预处理组，模型组和假手术组。假手术组、模型组、缺血预处理组以注射用水3ml/kg，每天灌胃1次，中药高、中、低剂量组分别按10、05、02g·kg-1·d-1 剂量灌胃给药。造模前连续给药1周，末次给药后1h造模。

　　15模型复制

　　按文献[2]方法复制大鼠在体心肌缺血/再灌注模型。缺血预处理组按经典murry[3]法结扎5min，再灌注5min，反复4次后结扎左冠状动脉近段30min，再灌注60min，之后断头放血取心脏。

　　16心肌细胞的急性分离[4-5]

　　大鼠断头放血后，迅速取出心脏，放置冰水混合无钙台式液修饰心脏多余组织(提前氧饱和)。然后将心脏固定在langendorff灌流装置上逆向灌流，用无钙台式液(37℃、体积分数95%o2+5%co2混合气饱和)灌流，5～10min后转换成用含ⅰ型胶原酶(05g/l)和牛血清白蛋白(1g/l)的无钙液灌流，流速7～9ml/min，灌流20～30min将心室肌剪下，放入高钾液中吹打使细胞脱落，并于4℃保存于高钾溶液里，6h后进行实验。

　　17单通道电流记录与分析[6-7]

　　采用细胞贴附式，记录心肌细胞膜上单通道ca2+电流，所记录到电流经epc9膜片钳放大器放大，高通滤波为10khz，低通滤波为20khz，用pulsefit+pulse采集入计算机，采样频率为50khz，采样时间为10s。实验中钳制电压由-50mv到+10mv节跃，持续时间200ms，采样间隔5s，以使ca2+通道从失活状态中恢复。采用pulsefit+pulse进行数据采集，用分析软件tac进行测量，测量通道开放和关闭时间的分辨率为02ms，以某一记录电压下的电流幅度的50%作为判断通道开放与关闭的转换。记录中通道呈单级或多级开放，对时间数据的分析仅选用单级开放。在每一钳制电压下分析指标有：平均开放概率、平均开放时间及平均电流幅值。

　　18统计学方法

　　采用spss110统计软件进行单因素方差分析。

　　2结果

　　21l型ca2+通道性状鉴定[6-7]

　　本实验采用110mmol/lba2+作为载体离子流，ca2+通道对ba2+的通透性较对ca2+更大，且胞外的ba2+可以抑制延迟性k+通道，减少k+电流。浴槽液为高钾等渗液，含140mmol/l天门冬酸钾，使胞内外k+浓度相同，静息膜电位为零，加在电极上的指令电压就是细胞膜内外的跨膜电位差。钳制电压为-40mv，指令电压依次为-50mv至+10mv，节跃为电压10mv，给予去极化刺激，测定在不同指令电压下可记录到内向单通道电流。在同一指令电压下，通道活动的电流幅度基本保持一致。通道呈单开放形式，闪烁样开放，活动较少，在去极化全过程中均开放，电流15~2pa左右。ca2+通道电流随着膜电位的改变而发生改变，以指令电压为横轴，通道的单一电流幅值为纵轴，作出iv曲线，曲线的斜率即为单通道的电导，即为ps，相对较大的电导是l型ca2+离子通道的典型特性。另外，随着去极化幅度加大，通道电流幅值逐渐降低，但通道的活动频率有所增加。浴槽内ttx可阻断na+通道，细胞膜上的cl-通道较少活动，故一般记录到的内向电流应为l型ca2+通道电流。

　　22各组l型ca2+通道平均开放概率、开放时间及电流幅值比较

　　表1、图1结果显示：与假手术组比较，模型组心肌细胞l型ca2+通道平均开放概率显著提高(p<001)，平均开放时间显著缩短(p<005)，平均电流幅值显著升高(p<005);与模型组比较，缺血预处理组和延胡索碱各剂量组可显著降低l型ca2+通道平均开放概率(p<001)，但对l型ca2+通道平均开放时间无显著影响(p>005)，延胡索碱中、低剂量组可降低l型ca2+通道平均电流幅值(p<005);与缺血预处理组比较，延胡索碱各剂量组对l型ca2+通道平均开放概率、平均开放时间的影响差异无显著意义(p>005)。表1各组l型ca2+通道平均开放概率、开放时间及电流幅值比较(x±s

　　3讨论

　　随着膜片钳技术的发明、改进与完善，ca2+通道药理学研究进入了一个崭新的阶段。目前发现心肌细胞上有b型、l型和t 型3种ca2+通道。b型ca2+通道即背景ca2+通道(background ca2+ channels)，或称漏流ca2+通道(1eak calcium channels)，即静息ca2+通道;l型(1ong lasting)ca2+通道是细胞兴奋过程中ca2+内流的主要途径;t 型(transient)ca2+通道功能与维持细胞自律性和低膜电位(接近静息膜电位)时ca2+的跨膜运动有关。后2种属电压依赖性通道(voltage dependent channels，vdcs)，在药理学上有着重要意义。其中l型ca2+通道是细胞兴奋过程中ca2+内流的主要途径。心肌细胞l型ca2+通道是动作电位2相平台期形成的离子基础，也是触发细胞内ca2+释放及细胞兴奋—收缩耦联的重要机制，对心肌细胞具有重要的生理和病理生理意义[8-9]。

　　31心肌细胞膜上l型ca2+通道的生理作用[5，8-10]

　　l型ca2+通道在决定心肌细胞动作电位特性和触发心肌收缩耦联中起着重要作用。细胞膜去极化引起l型ca2+通道开放ca2+内流，并触发肌浆网释放ca2+，为心肌细胞兴奋—收缩耦联中调节心肌收缩力的一个关键环节。l型ca2+通道受到交感、副交感神经、低氧、心律、腺苷等多因素的调节。ca2+经l型ca2+通道进入心肌细胞内触发了兴奋—收缩耦联过程，药物通过干预l型ca2+电流可影响肌浆网ca2+的释放和心肌细胞的收缩。

　　32ca2+超载是心肌缺血再灌注不可逆损伤的最后通路[5，8-10]

　　随着冠状动脉溶栓术、冠状动脉搭桥术、冠状动脉介入术等技术的推广应用，心肌缺血再灌注损伤成为阻碍缺血心肌从再灌注疗法中获得最佳疗效的主要难题。目前认为心肌缺血再灌注损伤发病机制主要有：能量代谢障碍、氧自由基产生、钙超载形成等。早期缺血、缺氧致能量代谢障碍是细胞内ca2+增高的首要原因，后期氧自由基大量产生致使心肌细胞膜和肌质网膜通透性增加，是心肌细胞发生不可逆损伤的重要环节，ca2+超载是缺血再灌注不可逆损伤的最后通路。ca2+超载在缺血再灌注损伤中起极其重要的作用，因此，防止ca2+超载是目前治疗心肌缺血再灌注损伤的关键。

　　33延胡索碱预处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞膜l型ca2+通道动力学的影响

　　本研究结果显示，心肌缺血再灌注大鼠经缺血预处理和延胡索碱预处理后，心肌细胞l型ca2+通道平均开放概率显著降低(p<001)，而且经延胡索碱中、低剂量预处理后可减弱l型ca2+通道平均电流幅值(p<005)，说明延胡索碱预处理和缺血预处理一样能阻止l型ca2+通道开放，抑制ca2+内流，减少钙内向电流，防止细胞内ca2+超载，从而保护心肌细胞的缺血再灌注损伤。但是，缺血预处理和延胡索碱药物预处理对心肌细胞膜l型ca2+通道平均开放时间无显著影响(p>005)，表明两者对心肌细胞膜l型ca2+通道动力学的影响不是通过改变通道的开放时间实现的。而且，经典缺血预处理和高剂量延胡索碱预处理对心肌细胞l型ca2+通道的平均电流幅值无显著减弱或抑制作用，提示：缺血预处理对心脏的保护作用不是通过影响ca2+通道电流实现的，延胡索碱预处理对ca2+通道电流的影响不呈量效关系。

　　综上所述，心肌缺血再灌注后心肌细胞膜上l型ca2+通道的平均开放概率显著增加，平均电流显著性增强，与文献[8]报道一致。缺血预处理和延胡索碱预处理可降低心肌细胞膜上l型ca2+通道的平均开放概率，而且一定剂量的延胡索碱预处理可显著减弱心肌细胞膜上l型ca2+通道平均电流幅值。延胡索碱预处理保护心肌缺血再灌注损伤的可能作用机制是：通过保护心肌细胞膜，减少心肌细胞膜上l型ca2+通道的平均开放概率、降低l型ca2+通道的钙内向电流，从而减少胞外ca2+的内流，避免了细胞内ca2+超载，最终达到保护心肌细胞、防止再灌注损伤的作用，确切机制有待进一步研究证实。

【参考文献】
　　[1]hoffman j w，gilbert t b，poston r s，et dial reperfusion injury etiology，mechanisms and therapies[j].j extra corpor technol，2004，36(4)：391

　　[2]王晓，刘磊，梁峰，等.大鼠在体心肌缺血/再灌注模型制备方法的改进[j].山西医科大学学报，2006，37(9) ：980.

　　[3] murry c e，jennings r b，reimer k ditioning with ischemia： a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[j].circulation，1986，75：1124.

　　[4]邓春玉，林曙光，吴伟康，等.缬沙坦对心力衰竭大鼠心肌细胞钙通道和钠—钙交换体电流的影响[j].中国病理生理杂志，2005，21(3)：465.

　　[5]齐书英， 刘坤申， 王鑫国， 等.黄芪对急性心肌梗死心室肌细胞钙电流的影响[j].中药药理与临床，2003，19(1) ：17.

　　[6]娄雪林，周专，康华光.单通道和全细胞记录技术[j]. 中国医疗器械杂志，2000，24(4)：221.

　　[7]陈军，李继硕.膜片钳实验技术[m].北京：科学出版社，北京，2001：1-5.

　　[8]杨孝芳，刘小雨，习君萍.心肌缺血再灌注损伤的钙信号调节[j].中国临床康复，2006，10(44)：93.

　　[9]徐志鑫，罗荣敬.中药对心肌细胞钙通道作用研究现状[j].中国心血管杂志，2003，8(6)：452.

　　[10]李和旺，韩启德.细胞外ca2+内流入胞质的机制[j].生理科学进展，1996，27(4)：307.

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