哺乳动物胰岛素样生长因子酸不稳定亚基的结构

　　胰岛素样生长因子(Insulin-likegrowthfactors,IGFs)信号系统在动物胚胎、胎儿的生长发育和骨的成熟中发挥着重要作用。IGFs信号通路不仅是正常组织细胞代谢的基础’也对恶性细胞的增殖、分化、凋亡和转移起着重要的调节作用，与许多癌症(如乳腺癌)的发展紧密相关；同时，IGFs系统还参与了一些代谢综合征与心血管疾病的发生过程[6]。游离的IGFs(包括IGF-1和IGF-2)的半衰期非常短，仅为10min，不足以维持其到达靶器官发挥作用，即使与胰岛素样生长因子结合蛋白-3(Insulin-likegrowthfactorbindingprotein-3,IGFBP-3)结合形成异源二聚体后，其半衰期也只增加了3~9倍，但是当这种异源二聚体和胰岛素样生长因子酸不稳定亚基(Insulin-likegrowthfactoracid-labilesubunit,IGFALS)结合形成异源三聚体后，其半衰期会显著延长，提高到原来的70多倍。因此，IGFs在合成分泌后主要以异源三聚体的形式存在，并通过血液循环系统运送到动物体内的各个靶器官，然后解离成游离的分子从而顺利的发挥其调节作用。

　　尽管早在1992年/GE4以基因的cDNA序列就巳经通过克隆获得，但是与IGFs系统的各种配体、受体和结合蛋白的研究程度相比，有关IGFALS功能的研究却一直局限于其延长IGFs半衰期方面[1'而在其他方面，如IGFALS影响IGFs对靶组织的功能，其详细的作用机制一直缺乏深入的研究。鉴于此，本文综述了IGFALS的基因结构及生物学功能的研究进展，以期为/GMZS基因功能的深入研究及应用提供参考。

　　1IGFALS基因结构及编码的氨基酸序列

　　1992年，Leong等利用人类肝脏来源的cDNA文库，首次分离、克隆得到/GMM基因的cDNA序列，该序列共编码578个氨基酸的成熟肽并含有27个氨基酸的信号肽(图1)。几乎同时，Dai和Baxter[11]以人IGFALS的cDNA序列作为探针又克隆出大鼠/GF4LS的cDNA序列，该序列长3.5kb，包含2个外显子(16bp、1796bp)和1个内含子(1116bp)，其中外显子1编码前5个氨基酸和第6个氨基酸的第一位，外显子2编码第6个氨基酸的后两位和剩余的599个氨基酸。

　　随后，/GiALS基因的全长序列又在小鼠上被克隆并被定位到小鼠17号染色体A2-A3区带。小鼠/GFALS基因大小约为3.3kb，由2个外显子(16bp、2060bp)和1个1126bp的内含子组成。IGFALS氨基酸序列包含18~20个由24个氨基酸残基组成的亮氨酸残基富集基序，这些重复序列占了IGFALS成熟肽的80%。亮氨酸残基富集基序成串排列，构成了IGFALS蛋白的主体结构，参与蛋白-蛋白间的相互作用，可与IGFBP-3或者IGFBP-3和IGF形成的二聚体结合。

　　近年来，有关家养动物IGFALS的研究也陆续被报道(表1)。绵羊/GFALS基因的序列全长为3.0kb，包含2个外显子(16bp、1957bp)和1个977bp的内含子，与人、小鼠/GFALS基因的序列相似性分别为80%和75%。绵羊IGFALS氨基酸序列包含18个由24个氨基酸残基组成的亮氨酸残基富集基序，12个半胱氨酸残基，其中11个的分布位点和人IGFALS相同。猪/GFALS基因的全长为2990bp，包含2个外显子(53bp、1947bp)和1个长度为990bp的内含子，其编码区长度为1775bp，与人、大鼠、小鼠以及狒狒/GFALS的相似性分别为54%、79%、79%和84%。基因编码606个氨基酸，信号肽长度为26个氨基酸，成熟肽则由580个氨基酸组成，猪的成熟IGFALS蛋白和人、大鼠、小鼠的相似性分别为74%、71%和71%，包含21个亮氨酸残基富集基序。牛/GFALS基因的成熟mRNA序列共编码611氨基酸，其中信号肽包括32个氨基酸，成熟肽包括579个氨基酸，共有12个半胱氨酸残基，主要集中在C-端和N-端。另外，牛的成熟IGFALS蛋白也包含20个亮氨酸残基富集基序。

　　总之，IGFALS基因在不同物种之间具有较高的保守性，其保守程度与物种的亲缘关系成正相关。

　　另外，IGFALS基因的启动子序列中包含了多个转录因子结合位点，如HNF-5、PEA3、Spl和干扰素激活序列。值得注意的是，小鼠、大鼠、绵羊和人的IGFALS基因5'端启动子序列中都没有TATA框和GC框。

　　1IGFALS蛋白的生物学特征

　　1.1IGFALS结构特征

　　人IGFALS蛋白大小为85kDa，包括65kDa核心肽和20kDa糖基化肽。巳有的研究揭示，IGFALS对游离的IGF-1和IGF-2无亲和力，对游离的IGFBP-3只有非常低的亲和力;但是，IGFALS却极容易与IGFs和IGFBP-3组成的异源二聚体结合形成异源三聚体复合物。IGFALS的结合能力表现出对酸碱环境的敏感性，在酸性条件下(pH<4.5)，IGFALS异源三聚体会被不可逆的破坏，这也是IGFALS得名的缘由。另外，IGFALS与IGFBPs的结合具有特异性：IGFBP-1/-2/-4/-6不能代替IGFBP-3和IGFALS形成三元复合物；而IGFBP-5在基因序列和蛋白质结构上都与IGFBP-3具有最高的相似性，因而也能够和IGFALS结合形成异源三聚体；但是，与IGFBP-3不同，IGFBP-5能够在缺少IGF的情况下与IGFALS发生微弱结合。IGFBP的功能域替换实验表明，IGFBP-3/5的羧基端是结合IGFALS的重要部件，结合活性中心则是由18个氨基酸组成的保守区域，并分别对应IGFBP-3的第201~218个氨基酸和IGFBP5的第215~232个氨基酸。另外，Twigg等的研究表明在羧基端区域缺失的情况下，IGFBP-5的中间区域也具备结合IGFALS的能力。

　　IGFALS蛋白在不同哺乳动物之间具有较高的保守性。例如，小鼠和大鼠的成熟IGFALS蛋白相似性高达93%，与人和绵羊IGFALS蛋白的相似性分别为79%和73%。其中，不同物种IGFALS的结构中拥有完全保守的区段，包括1个由12~13个半胱氨酸残基组成的区段、6~7个天冬酰胺串联的糖基化位点和18~20个由24个氨基酸残基为单元的亮氨酸富集区域。亮氨酸富集区域约占整个成熟肽的75%，并使IGFALS形成了内圈直径为1.7nm、外圈直径为7.2nm、厚度为3.6nm同心圆环的空间结构。由于富含亮氨酸，IGFALS蛋白的表面带负电荷。这些带负电荷的残基均匀地分布在同心圆环状结构的内表面，能够和IGFBP-3中的正电荷相互作用。它们和IGFALS蛋白中7个与N端相连的低聚糖附着位点一起，很可能提供了和IGF-1/IGFBP-3异源二聚体相互作用所必须的静电位，继而在形成异源三聚体的过程中起到非常重要的作用。Janosi等研究也表明，人IGFALS基因中的7个与N相连的多糖附着位点的任意一个发生独立突变，不会消除它和IGFBP-3形成异源三聚体的能力，但是全部都去糖基化就会使其失去这个能力。简言之，上述结果符合IGFBP-3/5上带正电荷并具有保守性的由18个氨基酸组成的区域和IGFALS上带负电荷的区域相吸引的结构特点。

　　1.2IGFALS的分布及表达量特点

　　IGFALS在动物体的合成与分布具有组织特异性。虽然IGFALS能够在某些组织中自由地合成，但其主要合成部位来自肝脏的浆细胞。尽管巳经在动物腹膜、滑膜、卵巢中检测到中低浓度的IGFALS，而在动物脑脊液、羊水、乳汁、淋巴液等组织中也检测到极低浓度的IGFALS;但是IGFALS主要存在于动物血液中。了3恥^等采用更为敏感的检测方法如原位杂交和表达序列标签在肾脏、泌乳乳腺、胸腺和肺脏等肝脏外的组织中检测到了IGFALS的表达。而Wandji等在猪卵巢的膜细胞和颗粒细胞中也探测到了/GFALSmRNA。这些发现表明IGFALS可能在上述组织发挥一定的作用，但其具体功能有待于进一步研究和揭示。

　　IGFALS蛋白的表达丰度在哺乳动物出生前后以及出生后的不同年龄阶段呈现出明显的变化。在动物出生前，IGFALS的表达量非常低；出生后，其表达量迅速升高。例如，大鼠在出生后，血液中的IGFALS蛋白水平快速上升，从大鼠出生到初情期，血液中IGFALS的浓度增加了5倍，成熟期时达到峰值并维持稳定状态，从而确保IGFs能够不断地被结合成150kDa的复合物，此时的浓度为570nmol/L；在老年大鼠体内，其浓度有所下降。在绵羊中，IGFALSmRNA的丰度在出生前也很低，但在出生后的7d内突然增加[13]。这种表达模式的出现可能是因为在绵羊出生前，IGF-1主要是以50kDa的复合物形式存在，而在出生后1周内主要是以150kDa复合物形式存在。另外，动物出生后，IGFALS的含量随着GH分泌物和肝脏细胞的GH受体的增加而上升。在循环系统中，IGFALS除了以异源三聚体的形式存在外，过量的部分还以游离的形式存在，约占其总量的50%~60%。

　　2IGFALS的生物学功能

　　2.1延长IGFs的半衰期

　　目前的研究巳经明确，IGFALS具有通过与IGFs-IGFBP-3/5结合形成异源三聚体蛋白复合物从而延长IGFs在血液中半衰期的功能。在哺乳动物血液中，游离的IGFs的半衰期仅为10min左右，而IGFs-IGFBP-3/5异源二聚体的半衰期则延长至到30~90min，当上述异源二聚体与IGFALS结合形成异源三聚体后，IGFs的半衰期则超过12h，是游离状态的72倍。尽管如此，在蛋白水解作用以及IGFBP-3和异源三聚体相互作用下，三聚体会自主分解释放出IGFs，从而导致血清中IGFs的异源三聚体和游离的IGFs分子的保持动态平衡，使得二者的比例维持稳定。

　　传统的观点认为，IGFALS不是调节IGFs的重要因素，因为相对于动物血液中过量的IGFs和IGFBP-3，IGFALS的含量较少。但这一观点可能需要修正，因为IGFALS与IGFBP-3和IGFs结合成复合物的缔合常数(Associationconstant)很低[18]。这一点在LoriUeki的研究中同样得到了验证，与正常小鼠比较，在/GFALS缺失杂合子的小鼠血液中，IGFALS的血浆浓度很低，IGF-1的浓度降低了17%，IGFBP-3的浓度降低了40%。

　　除了能延长IGFs半衰期，IGFALS还具有阻止IGFs非特异性的代谢效应功能(如造成严重的低血糖症状)。这主要是由于以异源三聚体形式存在的IGFs，其分子量较大，无法透过毛细血管壁去激活胰岛素受体；而异源二聚体和游离的IGFs却由于分子量很小，可自由穿过毛细血管壁，从而进一步发挥其生物学功能。

　　2.2IGF-1和IGFBP-3在血清中累积的必要条件

　　相关研究表明，IGFALS是动物血清中IGF-1和IGFBP-3累积的必要条件。Ueki等聞基于IGFALS缺失小鼠模型的研究发现，/GFALS基因的失活导致IGF-1/IGFBP-3/IGFALS异源三聚体的缺失。另外，相对于野生型小鼠，/GFALS缺失的小鼠体内循环系统中的IGF-1和IGFBP-3的浓度也明显的降低。在敲除/GFALS基因的小鼠模型中，其循环系统中完全没有IGFALS，IGF-1的血浆水平下降了62%，IGFBP-3的血浆水平下降了88%。但是在该小鼠模型中，IGF-1和IGFBP-3在肝脏中这些基因的表达和合成的主要位点均正常。此研究结果进一步说明IGFALS在血清中积蓄IGF-1和IGFBP-3是必需的成分。

　　2.3IGFALS对动物生长发育的影响

　　虽然多种动物的/GFALS基因序列巳经被克隆获得，但是关于IGFALS的分子作用机制及功能却鲜有报道，而且这些研究主要集中在人及小鼠上。近年来，日渐增多的人类临床医学报道表明，/GFALS基因序列的突变会导致儿童出现各种发育迟缓和生长缺陷，这进一步体现了IGFALS的重要生物学功能。Dome沾等最早发现当点突变造成的/GF4ZS基因失活后，血液中的IGF-1、IGFBP-3及IGFALS的含量非常低，且该病例表现出身材矮小、青春期的推迟、产生一定程度的胰岛素和生长激素抗性。随后，有关IGFALS的国际合作研究团队又陆续发现20多例关于IGFALS与生长发育迟缓的相关性的临床病例，这些个体的平均身高低于同期正常儿童身高的2倍标准差。

　　Dome沾等于2005年报道了/GFALS基因缺陷在人类和小鼠上有着许多相似的表型效应，进一步表明IGFALS的功能在哺乳动物生长发育中的重要性。而Courtland等利用/GAFLS基因敲除小鼠，揭示/GFALS基因缺失对小鼠的体尺和骨头大小具有性别特异性效应。敲除/GFALS基因的小鼠也表现出股骨骨膜延迟、皮质厚度和骨总量减少[36,37]。最近，根据小鼠模型实验，Flannery等p8]建议将IGFALS作为临床医学上检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)对人体生长抑制作用的生化标志物。

　　此外，〇肋等[39]利用3000~5000头瑞士褐牛公牛的样本群体，采用全基因组关联分析(GWAS)定位到牛25号染色体上包含IGFALS的2Mb长度的基因组区域与牛体高、泌乳量、乳脂率等多个数量性状呈现全基因组水平的显著性关联。而二比等_以秦川牛作为样本群体，采用候选基因方法，进一步发现IGFALS与牛体高存在显著性关联。有关家养动物的研究进一步体现出IGFALS在哺乳动物体内的重要生物学功能。郑凯迪[41]通过对斑马鱼的研究发现IGFALS能够促进卵母细胞的成熟，将注射的pALSMT质粒浓度提高到50ng/^L时，斑马鱼卵母细胞的成熟率迅速升高到95%左右，而注射空质粒并没有对斑马鱼卵母细胞的成熟造成影响。他同时指出，哺乳动物卵巢的/GFALS基因表达与斑马鱼类似，都是在滤泡层细胞中高表达。

　　3IGFALS的表达调控

　　3.1mRNA水平的调控

　　现有研究表明，生长激素(Growthhormone,GH)可能是/GFALSmRNA合成和血浆IGFALS合成的诱导物。Aguiar-Oliveira等发现完全缺乏GH的状态下血浆中几乎不含有IGFALS；另外，IGFALSmRNA出现和肝脏中功能性的GH受体的出现还具有时间关联。上述结果进一步支持了GH是IGFALS诱导物的观点。

　　Ooi等研究发现，在肝脏中GH的这种作用发生在/GFALS基因的转录水平。他利用小鼠肝脏细胞，鉴定出1个应答GH的启动子，并通过删除和突变分析将该元件定位到小鼠/GFALS基因633~625nt，大小为9bp。该序列被称为ALSGASi，因为它与y干扰素激活序歹1J(y-interferonactivatedsequence,GAS)一致。GH对/GFALS基因的效应通过JAK-STAT通路调节：酪氨酸激酶JAK2被募集继而激活GH受体形成二聚体，使信号转换器磷酸化，同时转录活化因子STAT-5a和STAT-5b。二聚作用后，STAT5同分异构体在核的位置发生变化，通过结合ALSG4Si元件来激活/GFALS基因的转录。GH的信号通路诱导/GFALS基因的转录增加很大程度上依赖于STAT5同分异构体的激活，而无需Ras蛋白的激活，因为共转染STAT-5a和STAT-5b的显性失活突变体能消除GH对细胞的刺激；然而，用Am基因的显性失活突变体和成型活化的Ras进行共转染不会引起类似的作用。

　　关于人类和绵羊IGFALS基因的研究则进一步证实GH激活IGFALS基因的机制。尽管小鼠、大鼠、绵羊和人的IGFALS基因的近端序列的相似度不高，但是它们的ALSGAS1元件在序列和位置上都具有高度的保守性。当被转染到肝脏细胞中，人和绵羊IGFALS基因的启动子也都会响应GH，而这种响应能力也需要ALSGAS1元件的存在。上述发现支持了GH刺激IGFALS基因的转录的机制。

　　白细胞介素-1P(IL-ip)能够通过阻碍IGFALSmRNA的转录来抑制其表达，但这种阻碍作用只有在GH诱导时才存在。在原代肝细胞中，白细胞介素-1卩会阻止IGFALS对GH的应答。这种效应的部分原因是由于其下调了GH受体的表达量。另外，白细胞介素-1P也可降低GH对IGFALSmRNA转录的促进能力，同时也能降低IGFALS启动子的活性。在IGFALS作为GH调节基因转录的模型中，白细胞介素-1P也表现出干扰STAT5的活性。这种干扰通过细胞因子信号抑制物3(Suppressorofcytokinesig?naling3,SOCS-3)来调控，它是JAK-STST通路的一个抑制因子，这也许是机体在炎症疾病过程中表现抵抗GH的重要机制。

　　3.2蛋白质合成和分泌的调节

　　在大鼠和人类的研究中，禁食、营养不良和代谢疾病(如糖尿病、烧伤、肝硬化)等外界或动物体内在生理特征的变化都会导致血清中IGFALS的减少。IGFALS的负调控发生在转录水平，也可以发生在转录后水平。地塞米松、cAMP和表皮生长因子主要通过降低IGFALS的转录水平降低大鼠原代肝细胞的IGFALS浓度。例如，当受到热损伤或肝功能衰竭时，糖皮质激素、细胞的cAMP的增加导致IGFALS的合成量显著下降。相反，胰岛素不足可能是在禁食、营养不良和糖尿病时引起血清中IGFALS浓度下降的主要原因。胰岛素的这种效应发生在转录后，因为在原代肝细胞中，在IGFALSmRNA没有变化的情况下，胰岛素能够促进IGFALS蛋白的合成。

　　而在肝脏中，细胞对GH排斥的增加也可以导致IGFALS合成的减少。近期研究发现，在肝脏细胞中，大多数cAMP和细胞白介素对IGFALS合成的负调控作用是通过对GH抵抗状态的感应产生的。在肝实质细胞中，cAMP对IGFALS蛋白的表达主要表现在蛋白质水平上的调节，胞内cAMP的增加对IGFALSmRNA水平的影响很微弱，也不会降低IGFALSmRNA的稳定性，但对IGFALS蛋白分泌具有明显的抑制作用，并且这种抑制效应具有剂量依赖性。当加入GH时，cAMP对!GiAZS*mRNA水平和IGFALS蛋白分泌均有明显的抑制作用。

　　5结语与展望

　　作为IGFs系统的组成部分，IGFALS的功能被长期忽视。但是，在过去的几年中，越来越多的证据表明IGFALS在IGF-1和IGF-2的功能发挥着中扮演着重要的角色，IGFALS基因和蛋白水平的异常均有可能导致动物体生长发育迟缓等表型缺陷。因此，有关IGFALS的研究也愈来愈受到重视并取得了进步，其中包括越来越多物种的IGFALS基因被克隆和定位；IGFALS基因和蛋白质中重要的结构被进一步明确，其生物学功能也被拓展；而IGFALS蛋白合成的调节机制也被初步探明。最近几年，有关IGFALS的研究主要集中在人类IGFALS基因突变所产生的一系列临床症状和对人体内分泌以及新陈代谢的影响。如Heath等发现IGFALS基因纯合突变会导致动物在出生后出现中度的生长缺陷和发育迟缓；血液中IGF-1/2和IGFBP-3的含量非常低，而胰岛素含量过多。Dome沾等又发现具有先天IGFALS缺乏症的患者都表现出一定程度的胰岛素抗性，但其病理学机制还不明确。Kennedy等在敲除IGFALS基因的小鼠上尝试用GH和IGF-1进行激素治疗IGFALS缺乏症等等。

　　综上所述，IGFALS功能及其作用机制的深入研究将有助于人们理解IGFs信号系统调节哺乳动物生长发育的机理，从而为一些生长代谢异常相关疾病的治疗提供理论基础。