基因芯片分析10Gy γ射线照射后肺癌细胞株H1299基

【摘要】 ［目的］ 初步筛选肺癌细胞株h1299在放射线照射后表达显著改变的基因，为将来的后续工作奠定基础。［方法］ 采用superarray基因芯片方法比较肺腺癌细胞h1299在放射照射后与对照组细胞间细胞周期和细胞凋亡相关基因表达谱的差异。实验重复2次，以差异为2倍以上且2次实验结果相一致的标准确定差异表达基因。［结果］ 各组样品中28s和18s rna 比例合适，无降解现象，可用于下一步的芯片分析。10gy照射中共有71个基因表达水平比对照组下降，29个基因表达水平上升，其中细胞凋亡相关改变2倍以上的有35个基因，细胞周期相关改变2倍以上的有65个。［结论］ h1299细胞经过放射照射后的细胞周期相关和细胞凋亡相关的基因改变，对肺癌放疗后的耐受可能机制的研究及通过基因芯片技术研究肺癌辐射抗性有重要价值。

【关键词】 肺肿瘤；基因芯片；辐射；基因表达谱

应液94°c孵育2min以变性cdna探针，然后迅速放入冰中冷却，此cdna探针即可用于杂交；⑥芯片杂交；⑦ 洗膜；⑧图象采集和数据分析：x-射线胶片曝光后，将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度tiff格式的图片文件保存。

1.3 数据处理

运行scanalyze软件，将灰度tiff格式图片的点阵转化为数字型数据，将此原始数据储存为microsoft excel文件。

2 结 果

人肺腺癌细胞h1299 10gy照射后继续培养48h,然后连同对照组细胞提取总rna，甲醛琼脂糖凝胶电泳，检测rna的质量，发现各组样品中28s和18s rna比例合适，无降解现象(图1)，可用于下一步的芯片分析，基因芯片点图见图2。

本研究采用的superarray基因芯片覆盖了细胞周期和细胞凋亡相关的273个表达基因cdna探针，非常适合大规模基因表达的筛选。对每个点的cy3、cy5信号强度分别进行分析，实验重复2次，最后以差异为2倍以上且2次实验结果相一致的标准确定差异表达基因。10gy照射中共有71个基因表达水平比对照组下降，29个基因表达水平上升，其中关于细胞凋亡相关改变2倍以上的有35个基因，细胞周期相关改变2倍以上的有65个。其中表达升高2倍以上凋亡相关基因10个（表1），周期相关19个（表2）；表达降低2倍以上凋亡相关基因25个（表3），细胞周期相关46个（表4）。

3 讨 论

细胞或组织器官的复杂分子调节系统可以对多种环境毒理因素起反应。机体的生理应激反应是通过复杂的信号网络实现的，在分子水平，不同的环境应激可能拥有一些共同的通路，其终末效应却往往是不同的。随着对细胞环境应激反应过程复杂性了解的不断深入，越来越使人们认识到经典的研究单个生物分子的方法已经不能解决这样的问题。基因芯片技术提供了一种可以实时检测数千乃至数万个基因表达变化的手段，已有实验室建立了专门检测电离辐射信号反应通路的基因芯片技术sct，该技术同样也可以用来检测其他环境毒理因素作用，以及从器官和整体生物学水平进行同样研究。

由于实验手段所限，在20世纪90年代，有人猜测哺乳类细胞缺乏明显的电离辐射导致dna损伤的应激基因反应，尽管当时已经发现酵母菌有约1%的辐射反应基因。后来陆续发现，电离辐射和其他dna损伤因子可以引起许多哺乳类细胞中多达数百种基因变化，其中有一些可能是特异性辐射损伤反应（如一些dna损伤修复基因和机体内隐伏病毒基因激活等），更多的则是电离辐射触发非特异性损伤的“共同通路”反应基因，如生长因子、细胞周期蛋白和许多原癌基因的活动等等。它们通常亦可出现于许多其他生理应激反应过程中，如dna碱基损伤因子导致早期反应基因c-fos、c-jun表达，可以见于许多其他生理反应。

本研究研究显示10gy照射中共有71个基因表达水平比对照组下降，29个基因表达水平上升，其中关于细胞凋亡相关改变2倍以上的有35个基因，细胞周期相关改变2倍以上的有65个。表达升高2倍以上凋亡相关基因10个，周期相关19个，表达降低2倍以上凋亡相关基因25个细胞周期相关46个。值得注意的是表达下降的基因几乎都与细胞间信号转导、细胞周期调控相关，如缬酪肽包含蛋白valosin-containing protein，vcp)，分泌型亮氨酸富集重复序列蛋白(secreted leucine richrepeat containing protein，slit)，鸟苷三磷酸酶活化蛋白(rho2gtpase activating protein，rho2gap)，白介素增强子结合因子3(interleukin enhancer binding factor3，ilf3)，膜突蛋白(moesin，msn)和tpx2等。vcppp97基因表达产物为一膜结构蛋白，参与受体介导的细胞摄粒作用和细胞器高尔基体的拣选[3]，vcppp97还能通过激活nf-κb信号通路参与抗凋亡和肿瘤浸润转移的作用。有研究表明，vcp蛋白在肝癌、肺癌、前列腺癌、食管癌等多种肿瘤组织中表达增加，与肿瘤恶性程度相关[3,4]。slit 蛋白为正常神经发育所必需，参与器官生成[5，6]。arhgap10基因编码rho-gap蛋白，是rho-gtpase信号通路负反馈蛋白，与细胞骨架活动、细胞增殖及分化相关[7]。ilf3基因有多个转录本，表达产物包括ilf3蛋白、mmp4、nf90、drbf76等，属于双链rna结合蛋白家族。这些蛋白功能主要是参与细胞周期调控和dna损伤修复[8]。moesin蛋白是erm家族成员之一，参与细胞骨架构成，在维持细胞形态及运动、细胞间识别、细胞间信号转导等方面起着重要作用[9]。

本研究中还发现，一些参与细胞增殖的基因，如mdm2、bcl-2、pkcz和pim2在细胞照射后表达水平明显增加，一些参与dna修复的基因，如xrcc5、ercc5、ercc1、ercc4、rad9a和dna2pk在细胞照射后的表达水平比在对照组细胞中高。这些基因可能参与了细胞辐射抗性的形成，是细胞致敏的潜在靶点。

许多研究都证实，在辐射致癌剂量范围内，辐射诱导的突变率极低，推断在辐射致癌的发生过程中，更重要的是许多基因调节过程异常，其中涉及大量基因的开关及其调节，应用基因芯片技术可以实时检测这些基因，可以在这些浩瀚的基因变化中寻找其蛛丝马迹。已有资料显示，在不同基因背景，辐射反应基因活动的变化很大，提示生物细胞对环境有害因素反应的复杂性，也提示基因调控在正常组织和肿瘤分化增殖过程中的重要意义，因此，基因芯片技术可能发展成为肿瘤治疗和其他环境毒理研究的检测和预测方法。

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