经生理盐水浸润病损上皮标本的直接免疫荧光诊

摘　要：目的：对取自存有上皮分离征的口腔黏膜病损周缘上皮标本，经生理盐水浸润后作直接免疫荧光（DIF）检查，以观察这种检材对诊断天疱疮是否能增强其敏感性。方法：选取26例临床可疑为口腔天疱疮患者，在病损周缘分离上皮剪取标本，标本再一分为二，一种用生理盐水浸润置入标本瓶，另一仅置入洁净标本瓶内送至实验室做DIF技术检查。结果：26例经生理盐水浸润的标本的DIF全部阳性（IgG）（100%），呈现棘层细胞间清晰易辨的特征性亮绿色网状荧光，而26例未作标本生理盐水浸润只有17例阳性（65%），绿色荧光偏暗。结论：对临床可疑为口腔天疱疮患者，其口腔黏膜病损周缘的分离上皮组织标本，经生理盐水浸润后作DIF检查，可增强DIF的敏感性，方法可靠、得当和标本取材便易。

关键词：分离上皮；脱落细胞；直接免疫荧光；天疱疮
    直接免疫荧光（Direct immunofluorescence，DIF）技术是诊断口腔天疱疮的金标准，其敏感性高，特异性强^[1-2]。DIF的传统取材要求是全层黏膜组织，但口腔天疱疮患者的黏膜因有上皮分离征，若要切取包括黏膜下层在内的完整全层黏膜组织，操作相当困难而且容易引致较大的创伤，甚至要多次重复操作才成功，患者较难接受。基于上述原因，十多年来，对于有上皮分离征的临床疑为口腔天疱疮病例，需要作DIF检查以确诊者，获取标本方法作了改变：在病损周缘分离上皮剪取标本，标本再一分为二，一种标本用生理盐水浸润置入标本瓶，另一标本仅置入洁净标本瓶内送至实验室做DIF技术检查，先后共作了26例，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1  一般资料：选取临床诊断为口腔天疱疮患者，服用皮质激素和免疫抑制剂的患者除外。先后共选26例（为本院口腔科1990年～2011年门诊就诊患者），其中男14例，女12例，年龄36～60岁，平均42岁。

1.2  门诊标本的取材：对每一患者的同一病损标本作如下处理。病损周缘的分离上皮组织：在病损缘，用镊子轻揭残壁，使上皮分离，剪取约1 cm´2 cm上皮组织，标本一分为二，一种用生理盐水浸润置入标本瓶，另一种仅置入洁净标本瓶内送至实验室做DIF技术检查。

1.3  实验室DIF检查：在两种标本上加滴荧光标记的兔抗人IgG、IgA、IgM、C₃（丹麦DAKO公司产品），置入37℃温箱内孵育30 min，pH值7.2 PBS洗涤，荧光显微镜下观察，细胞间或细胞周围出现亮绿色为阳性。

2 结果

2.1  经生理盐水浸润的上皮组织标本：所有26例标本的DIF检查结果是IgG阳性，光镜下呈现棘层细胞间清晰易辨的特征性亮绿色荧（网状），未发现有基底细胞层。

2.2  无生理盐水浸润的上皮组织标本：26例涂片标本中有17例IgG阳性，绿色荧光偏暗。另有6例IgG阴性。

3 讨论

    天疱疮是一种严重的自身免疫性皮肤黏膜疱性疾病，由抗表皮中桥粒芯糖蛋白1（Dsg₁）和3（Dsg₃）的自身抗体与抗原结合后，激活蛋白水解酶，致细胞间黏附性丧失、棘层松解，形成表皮（上皮）內疱，表现为薄壁水疱，尼氏征阳性，是临床诊断的重要依据。其常见类型是寻常型天疱疮（Pemphigus vulgaris，PV），其主要抗原为抗表皮（上皮）中桥粒芯糖蛋白（Dsg₃）。大多数PV的早期病损首先出现在口腔，且口腔出现水疱很快破溃，临床检查时绝大多数仅见到范围教大的糜烂面。直接免疫荧光（DIF）技术是诊断天疱疮的一种可靠方法，被认为是诊断金标准，其特异性强。DIF的检材传统要求是黏膜全层组织，但口腔天疱疮患者病损黏膜上皮存在棘细胞层松解，上皮极易分离。如果要切取完整全层的黏膜组织（包括基底细胞层及黏膜下层）则较难掌握，常常出现已切取出来的黏膜块会分离成为两片（上皮棘细胞层片与基底细胞层及其黏膜下层组织片）。由于操作相当困难而且容易引致较大的创伤，甚至要多次重复操作才成功，患者较难接受。相比之下，如果仅以分离上皮作检材，切取则容易得多。因黏膜病损本身已有上皮分离的倾向，只需在病损缘轻揭分离，即可切取所需的上皮组织。实际上，PV病理特点基底细胞层上的上皮内疱，基底细胞不松解。PV病损缘分离上皮组织是除基底细胞层以外的上皮组织，因此，以这种检材作DIF检查，已足可观察到天疱疮的特征性免疫学现象——棘层细胞间的绿色荧光（网状），由此可作出确诊。本研究26例口腔黏膜病损缘的分离上皮组织经生理盐水浸润的标本，DIF检查结果全部为IgG阳性，呈现棘层细胞间清晰易辨的特征性亮绿色网状荧光，足见其敏感性之高，提示在黏膜病损周缘分离上皮组织获取标本，可取代全层黏膜组织作DIF检查，以明显减轻患者的创伤和痛苦。而未经生理盐水浸润的上皮组织标本，只有17例阳性（65%），绿色荧光偏暗，提示分离上皮组织未经生理盐水浸润，其输送实验室作过程中明显影响了上皮细胞的生物活性，结果减弱了DIF的敏感性，相反，经生理盐水浸润上皮组织的DIF， 棘层细胞间的绿色荧光明亮，说明其上皮细胞的生物活性保持较好，从而增强DIF的敏感性^[3]。

4 参考文献

[1] Pohla-Gubo of immunofluorescence microscopy in dermatology[J].G Ital Dermatol Venereal,2011,146(2):127.

[2] 侯存军.天疱疮的诊断及治疗研究进展[J].中国皮肤性病学杂志,2008,22(2):115.

[3] Vodegel RM,De Tong ed diagnostic immunofluorescence using biopsies transported in saline[J].BMC Dermatol,2004,4(10):1378. 本文链接：http://www.qk112.com/lwfw/yxlw/linchuangyixue/94632.html