蚂蝗及其混淆品菲牛蛭的高效毛细管电泳法鉴别

作者：刘兴国， 贾靓， 田青存，宋剑，贾继明

【摘要】 　　目的探求更为快捷、准确的水蛭药材的鉴定方法。方法采用高效毛细管电泳法对蚂蝗和混淆品菲牛蛭进行蛋白多肽的分析。条件为石英毛细管 (75 μm×57 cm )，电解缓冲液为20 mmol/l，硼酸盐溶液（ph 8.5），电压为20kv， 检测波长254 nm。结果蚂蝗与菲牛蛭的高效毛细管电泳图谱之间有明显差异，重复性良好。结论高效毛细管电泳可作为鉴定方法，用于快速准确地鉴别蚂蝗与菲牛蛭。

【关键词】 高效毛细管电泳 生药鉴别 蚂蝗 菲牛蛭

　　abstract：objectiveto investigate an easy and accurate method for the identification of whitmania pigra whitman and poecilobdella manillensis. methodsthe protein polypeptides in whitmania pigra whitman and poecilobdella manillensis were analyzed by high performance capillary electrophoresis(hpce). resultsthe hpce result showed that the protein polypeptide of whitmania pigra whitman was significantly different from that of poecilobdella manillensis. conclusionhpce can be used for the identification of whitmania pigra whitman and poecilobdella manillensis .

　　key words：high performance capillary electrophoresis； identification； whitmania pigra whitman； poecilobdella manillensis

　　医用水蛭的品种较多，被《 中国 药典》收载的有3种：①蚂蝗（宽体金线蛭，whitmania pigra whitman）；②水蛭（日本医蛭，hirudo niponnica whitman）；③柳叶蚂蝗（尖细金线蛭，whitmania acranulata whitman）。其中，蚂蝗是市场上的主要品种。对于水蛭药材采用tlc［1］和sds-page电泳法［1，2］、高效液相色谱法［3］进行鉴别分析曾有 文献 报道。为探求一种更为简便快捷准确的鉴别方法，实验通过高效毛细管电泳对蚂蝗和非药典品种菲牛蛭的蛋白类成分进行了鉴别研究。

　　 1 仪器与试剂

高效毛细管电泳仪（beckman coulter p/acetm mdq capillary electroplioresis system）；石英毛细管（75μm×57cm，beckman ecap capillary tubing）；离心机（飞鸽tgl-16c，上海安亭 科学 仪器厂）。试剂均为分析纯。实验用蚂蝗及菲牛蛭样品由河北省药品检定所中药鉴定室孙宝惠主任药师鉴定。

　　 2 方法

　　2.1 电泳条件电解缓冲液为20 mmol/l硼酸盐溶液（ph8.5），电压为20 kv，温度20℃，紫外检测波长为254 nm，压力进样，时间10 s。开机后先用0.1 mol/l naoh冲洗毛细管2 min，再用去离子水冲洗5 min，然后用缓冲液冲洗至基线平稳后开始进样， 每两次进样之间设定缓冲液冲洗2 min。

　　2.2 样品溶液的配制取生药样品约0.5 g，加入蛋白提取液5 ml，在冰浴中研磨成浆状，转移至离心管内，以5 000 r/min离心20 min，取上清液备用。tris-甘氨酸提取液：tris 0.6 g，甘氨酸2.88 g，加蒸馏水溶解至1 000 ml；碱性蛋白提取液：tris-hcl 0.1 mol/l，0.1%抗坏血酸，巯基乙醇10 mmol/l，ph = 8.0；酸性蛋白提取液：枸椽酸80 mmol/l，na2hpo4 32 mmol/l，抗坏血酸5 mmol/l，巯基乙醇10 mmol/l，ph= 2.8。

在酸性提取液中，蚂蝗主要在6.22，7.15，8.05，16.67 min处各有一吸收峰，其中8.05和16.67 min时为强吸收；而菲牛蛭在8.05，9.09，11.36 min处各有一吸收峰，其中8.05和9.09 min时为强吸收。

在中性提取液中，蚂蝗主要在5.89，6.84，7.98，9.17 min，13.99 min处各有一吸收峰，其中7.98 min和9.17 min为强吸收；而菲牛蛭在5.24，6.97 min和8.00 min处各有一吸收峰，且吸收都比较弱。

在碱性提取液中，蚂蝗主要在7.06，7.37，9.82，10.15 min和12.44min处各有一吸收峰，其中10.15 min和12.44 min处为强吸收；而菲牛蛭在4.97、6.23，6.90和10.99 min处各有一吸收峰，其中6.23 min和10.99 min时为强吸收。

hpce是近年来迅速 发展 起来的一种重要分离技术，在中药鉴别、中药分析与质量控制等方面显示出越来越广阔的应用前景［4］。蛋白受遗传基因控制，具有种的特异性，对蚂蝗与菲牛蛭药材用3种不同ph梯度的蛋白提取液分别提取得到的蛋白溶液进行hpce分析，从得到的蛋白谱带可以看出，蚂蝗与菲牛蛭的酸性，中性，碱性蛋白多肽的hpce图谱种间差异明显，很容易加以区别。高效毛细管电泳可作为鉴定方法，用于快速、准确的鉴别蚂蝗与菲牛蛭。

【 参考 文献 】
　　［1］丁家欣，张秋海，欧兴长，等.三种水蛭的薄层色谱和电泳法鉴别［j］.中药材，1994，17（11）：19.

　　［2］江佩芬，卢建秋，王宝华.水蛭蛋白电泳鉴别研究［j］.