【关键词】甲基亚砷酸(mmaⅲ)；砷中毒；enos磷酸化；活性氧自由基(ros)
摘要：目的观察无机砷的活性中间产物甲基亚砷酸(mmaⅲ)对牛主动脉血管内皮细胞(baec)的内皮型一氧化氮合酶(enos)磷酸化以及活性氧自由基(ros)产生的影响。方法培养的baec分别暴露于mmaⅲ(075μmol/l，0～15min)；亚砷酸钠(iasⅲ，100μmol／l，0～60min)；或n乙酰半胱氨酸（nac，1mmol／l)预处理2h后，再暴露于mmaⅲ(075μmol／l，0～15min）。收获细胞悬液进行enos磷酸化蛋白的westernblot分析；应用二氯二乙酰荧光素法(h2dcfda)观测细胞内的ros产生。结果baec暴露于mmaⅲ(075μmol／l)15min后，enosser1179磷酸化显著增加（p<005)，nac预处理(1mmol／l)能够抑制这一现象；iasⅲ暴露也能够诱导enosser1179磷酸化（p<005)，但是需要高浓度和更长的暴露时间(100μmol／l，30min)；mmaⅲ(075μmol／l)暴露能够诱导baec产生ros，nac预处理(1mmol／l)能够抑制这一现象。结论mmaⅲ暴露能够诱导细胞内产生ros以及ros依赖性enos磷酸化。
关键词：甲基亚砷酸(mmaⅲ)；砷中毒；enos磷酸化；活性氧自由基(ros)
studyonenosphosphorylationinducedbymonomethylarsonousacid
libing,wangyi,sunguifan.
departmentofoccupationalhealth,schoolofpublichealth,chinamedicaluniversity(shenyang110001,china)
abstract：objectivetoobservetheeffectsofmonomethylarsonousacid(mmaⅲ)onenosphosphorylationandreactiveoxygenspecies(ros)generationinbovineaorticendothelialcells(baec).methodsculturedbaecwasexposedtommaⅲ(075μmol/l,0～15min)withoutorwithacetylcysteine(nac)pretreatment(1mmol/l,2h),oriasⅲ(100μmol/l,0～60min).wellularrosgenerationwasassessedwiththefluorescentprobe,2',7'dichlorodihydrofluoresceindiacetate(h2dcfda).resultsmmaⅲ(075μmol/l)causedarapidincreaseinphosphorylatedenosser1179at15minafterexposure(p<005).incontrast,upto100μmol/liasⅲcausedtheincreaseofphosphorylatedenosser1179at30min(p<005).mmaⅲemmaⅲinducedenosser1179phosphorylationandrosgenerationwereblockedbynacpretreatment(1mmol/l,2h).conclusionmmaⅲexposurecaninducerosgenerationandrosdependentenosphosphorylation.
keywords：monomethylarsonousacid(mmaⅲ);arsenicpoison;enosphosphorylation;reactiveoxygenspecies(ros)
无机砷的体内代谢中间产物甲基亚砷酸(mmaⅲ)比无机砷的细胞毒性和遗传毒性更强〔1〕，因此其毒性效应是砷中毒发病机制研究的一个新热点。研究表明，无机砷能够激活人类角质细胞和白血病jurkat细胞的内皮型一氧化氮合酶(enos)磷酸化〔2，3〕，还可以诱导产生h2o2和超氧阴离子自由基(o・-2)等活性氧自由基(ros)〔4〕。本研究观察mmaⅲ对牛主动脉血管内皮细胞(baec)的enos磷酸化以及ros产生的诱导作用。
1材料与方法
11主要试剂和仪器mmaⅲ(ch3aso，获赠自加拿大cullenwr实验室)；亚砷酸钠(iasⅲ，wako)；n乙酰半胱氨酸(nac，wako)；二氯二氢二乙酰荧光素(h2dcfda，molecularprobes)；co2细胞培养箱(kendro)；电泳仪和转膜装置(atto)；共聚焦荧光显微镜(leicamicrosystems)。
12细胞培养baec培养于高糖培养基（dmemf12)(sigma)，添加成分包括10％胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10u/ml肝素和5ng/ml成纤维细胞生长因子。37℃，5％co2常规培养。
13enos磷酸化的westernblot分析暴露因素包括mmaⅲ(075μmol/l，0～15min)；iasⅲ(100μmol／l，0～60min)；或nac(1mmol／l)预处理2h后，再暴露于mmaⅲ(075μmol／l，0～15min)。加入细胞裂解液收获细胞悬液，低温离心后取上清冻存备用。十二烷基磺酸钠（sds）聚丙烯酰胺凝胶后进行蛋白印迹（westernblot）分析。特异性一次抗体为抗phosphoenosser1179抗体和抗enos抗体(分别1：1000稀释)；特异性二次抗体为hrp标记的抗兔或抗小鼠二次抗体。自显影胶片扫描后用adobephotoshop701软件处理输出，并进行定量分析。共进行独立实验3次。
14细胞内ros产生的荧光测定应用荧光染料h2dcfda。具体实验步骤为：80％融合的baec细胞加入5μmol／lh2dcfda孵育20min后暴露mmaⅲ(075μmol／l，0～15min)；或nac(1mmol／l)预处理2h的最后20min加入h2dcfda共同孵育，然后暴露于mmaⅲ(075μmol／l，0～15min)。用倒置荧光显微镜观测细胞内的ros产生。激发光和发射光波长分别为480和527nm。共进行独立实验3次。
15统计分析应用spss100统计软件进行单因素方差分析和q检验。
2结果
21mmaⅲ或iasⅲ暴露对enosser1179磷酸化的影响baec暴露于075μmol／lmmaⅲ15min后，enosser1179磷酸化显著增加（p<005)，为对照组的141倍(图1)。而相同实验条件下，100μmol／liasⅲ暴露30min才可诱导enos
ser1179磷酸化（p<005)，为对照组的132倍(图2)。各实验组的细胞内总enos蛋白含量没有变化。
a：westernblot的典型结果
图1mmaⅲ暴露对enosser1179磷酸化的诱导作用（略）
a：westernblot的典型结果
图2iasⅲ暴露对enosser1179磷酸化的诱导作用（略）
22mmaⅲ暴露诱导ros依赖性enosser1179磷酸化和细胞内ros产生nac预处理(1mmol／l)抑制mmaⅲ(075μnol／l)暴露诱导的enosser1179磷酸(图3)。dcf荧光检测法表明，mmaⅲ(075μmol／l)暴露确实能够诱导baec产生蓝绿色荧光，提示有ros的生成，并且nac预处理(1mmol／l)后，蓝绿色荧光显著减弱，提示ros生成可以被抑制。
图3nac预处理抑制mmaⅲ暴露诱导的enosser1179磷酸化（略）
3讨论
ser1179是enos分子2个最重要的磷酸化位点之一。研究表明，ser1179磷酸化通过在ser1179基团增加一个负电荷而增加enos还原酶区域的电子流动、以及降低钙调蛋白―enos复合物解离这两个方面，引起enos活化〔5〕。enos磷酸化对于机体的enos活化具有重要作用。本研究发现，075μmol／lmmaⅲ暴露15min后，enosser1179磷酸化显著增加，提示mmaⅲ暴露初期可能诱导体内的enos活化。iasⅲ暴露也能够诱导enosser1179磷酸化，但是需要高浓度和更长的暴露时间，提示iasⅲ的细胞效应可能是通过其代谢中间产物mmaⅲ间接作用的结果。本研究中，mmaⅲ诱导产生的enosser1179磷酸化能够被抗氧化剂nac有效抑制，提示内皮细胞产生的ros可能在其中发挥作用。进一步应用dcf荧光检测观测到mmaⅲ(075μmol／l)暴露产生的荧光，并且这种荧光也可以被nac预处理所抑制，提示mmaⅲ暴露激活enosser1179磷酸化具有ros依赖性。本研究表明，mmaⅲ暴露能够诱导细胞内产生ros以及ros依赖性enos磷酸化。
(本研究得到中日川
医学研究者制度的支持和日本筑波大学熊谷嘉人教授的指导，在此一并表示感谢)
参考文献
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〔2〕souzak,maddockda,zhangq,teactivationofp13k/aktcellsurvivalpathwayismediatedbyp38inculturedhumankeratinocytes［j］.molmed,2001,7:767-772.
〔3〕hossaink,akhandaa,kawamotoy,eactivationisacceleratedbytheinhibitionofarseniteinduced,membraneraftsdependentaktactivation［j］.freeradicbiolmed,2003,34:598-606.
〔4〕kumagaiy,larbasisforarsenicinducedalterationinnitricoxideproductionandoxidativestress:implicationofendothelialdysfunction［j］.toxicolapplpharmcol,2004,198:450-457.
〔5〕mccabetj,fultond,romanlj,edelectronfluxandreducedcalmodulindissociationmayexplain“calciumindependent”enosactivationbyphosphorylation［j］.jbiolchem,2000,275:6123-6128.
(宋艳萍编校)
作者单位：
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