银杏内酯B衍生物对血栓形成的抑制作用

作者：崔姣,潘苏华,刘成鼎,许惠琴

【摘要】 　　【目的】 观察银杏内酯b衍生物(xq)对实验性血栓形成的影响。【方法】选用sd雄性大鼠随机分为模型对照组,曲克芦丁组(剂量为48 mg·kg-1·d-1),银杏内酯b(gb)组(剂量为78 mg·kg-1·d-1),xq低、中、高剂量组(剂量分别为39、78、156 mg·kg-1·d-1)。分别采用颈动—静脉旁路法复制血栓模型及电刺激法复制混合血栓模型,观察xq对血栓形成的影响。选用icr雄性小鼠随机分为模型对照组,曲克芦丁组(剂量为96 mg·kg-1·d-1),gb组(剂量为156 mg·kg-1·d-1),xq低、中、高剂量组(剂量分别为78、156、312 mg·kg-1·d-1)。采用5腺苷二磷酸二钠盐(adp)致小鼠急性肺血栓模型,观察xq对血栓形成的影响。【结果】xq中、高剂量组均能显著减轻大鼠动脉血栓的湿、干质量(与模型对照组比较,p＜005或p＜001),显著延长大鼠混合血栓形成时间(与模型对照组比较，p＜005)。xq高剂量组对小鼠急性肺血栓形成有抑制作用,并可显著缩短小鼠的喘促持续时间(与模型对照组比较，p＜005)。【结论】 xq具有一定的抗血栓形成作用。

【关键词】 银杏内酯b衍生物/药理学 血栓形成/中药疗法 疾病模型,动物 大鼠 小鼠

　　abstract: objectiveto observe the effect of ginkolide b derivative (xq) on animal thrombosis. methodssd male rats were randomized into the model group, troxerutin (48 mg·kg-1·d-1) group, ginkolide b(78 mg·kg-1·d-1) group, and low, middle and highdose xq (in the dose of 39, 78 and 156 mg·kg-1·d-1 respectively) groups. the antithrombotic effect of xq was observed on rats mixed thrombosis model induced by arteriovenous shunt method and electrical stimulation. meanwhile, icr male mice were randomized into the model group, troxerutin (96 mg·kg-1·d-1) group, ginkolide b(156 mg·kg-1·d-1) group, and low, middleand highdose xq (in the dose of 78, 156 and 312 mg·kg-1·d-1 respectively) groups. the antithrombotic effect of xq was also observed on mice acute pulmonary embolism model induced by adenosine diphosphate (adp).resultsxq at the dose of 78 and 156 mg·kg-1·d-1 decreased the dry and wet weight of the thrombosis, and obviously prolonged the formation time of rats carotid artery thrombosis as compared to the model group (p<005 or p<001). xq in the dose of 312 mg·kg-1·d-1 shortened dyspnea duration in mice with acute pulmonary embolism (p<005 compared to the model group). conclusionxq has certain antithrombotic effect．

　　key words: ginkolide b derivative/pharmacology;thrombogenesis/tcd therapy;disease models,animal;rats;mice

　　银杏内酯b是银杏科银杏属植物银杏(ginkgo biloba l.)的提取物,其在心脑血管方面的药用价值已经被全世界所公认［1］。银杏内酯b衍生物(xq)是在母体的基础上增加了水溶性的基团,前期实验研究［2］表明xq体内外给药能抑制血小板活化因子(paf)、5腺苷二磷酸二钠盐(adp)、酸溶性胶原(col)、花生四烯酸(aa)等诱导血小板的聚集。为进一步研究xq的药理作用机制,本实验观察了其对体内外血栓形成的影响,现报道如下。

　　1　材料与方法

　　1.1　受试药物及药品

　　银杏内酯b衍生物(xq)由南京柯菲平医药科技有限公司提供,批号：060301；银杏内酯b(gb),为白色结晶体,分子量为4244 g/mol,由合肥标品生物技术有限公司提供,批号：051001；曲克芦丁注射液由天津药业焦作有限公司提供,批号：05072721。
　
　　1.2　试剂
　
　　adp为sigma公司产品,批号：yy1124b056w，氯化钠注射液为南京小营制药有限公司产品,批号：2005090101，戊巴比妥钠由中国医药(集团)上海化学试剂公司(进口分装)提供,批号：f20020405，肝素钠注射液为江苏万邦生化医药股份有限公司产品,批号： 0601101，葡甲胺为成都科东化工有限公司产品,批号：20060320。

　　1.3　实验动物

　　雄性清洁级sd大鼠,体质量250～280 g,由中国人民解放军医学动物实验中心(南京军区南京总医院)提供,生产许可证号：scxk(苏)20030004。spf级icr小鼠,体质量20～22 g,乾元浩生物股份有限公司南京生物药厂提供,生产许可证号：scxk(苏)20020030。

　　1.4　实验仪器
　
　　fa2104上皿电子天平为上海精科公司产品，bt873型实验性体内血栓形成测定仪由包头医学院心血管研究室提供，dhg9123a型电热恒温鼓风干燥箱由上海精宏实验设备有限公司提供。

　　1.5　方法

　　1.5.1　xq 对颈动—静脉旁路丝线上血栓形成的影响 ［3-4］取雄性sd大鼠48只,按体质量随机分为6组,即模型对照组,曲克芦丁组(剂量为48 mg·kg-1·d-1),gb组(剂量为78 mg·kg-1·d-1),xq低、中、高剂量组(剂量分别为39、78、156 mg·kg-1·d-1)。各组均尾静脉给药,容积为5 ml/kg,连续5 d,模型对照组给予等容积的生理盐水。给药第5天,大鼠以10 mg/l戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)麻醉,分离右颈总动脉及左颈外静脉。在3段聚乙烯管中放入1根长约6 cm的4号手术丝线。以50 u/ml肝素生理盐水溶液充满聚乙烯管腔,当管的一端插入左颈外静脉后,从聚乙烯管注入肝素(50 u/kg),夹住管壁,将管的另一端插入右颈总动脉,然后尾静脉给药。给药5 min后开放血流并计时,15 min后中断血流。迅速取出丝线称质量,用总质量减去丝线质量即为血栓湿质量。将丝线70 ℃烘干,取出称质量,总质量减去丝线质量即为血栓干质量。按下列公式计算抑制率：p抑制,湿质量(%)=(m湿,对照组 – m湿,给药组)/m湿,给药组×100%；p抑制,干质量(%)=(m干,对照组 – m干,给药组)/m干,给药组×100%。

　　1.5.2　xq对电流损伤大鼠颈总动脉内膜后混合血栓形成的影响［4-5］分组及给药方法同151项下。给药第5天,大鼠以10 mg/l戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)麻醉，分离右侧颈总动脉(长约15 mm)，用塑料薄膜与附近组织隔开,在动脉近心端放刺激电极,远心端下放连接仪器的温度测头，然后尾静脉给药。给药5 min后,打开仪器开关,以16 ma直流电刺激动脉7 min,使刺激部位的血管内皮受损,激活血小板和凝血系统,管腔混合血栓逐渐形成,血流逐渐阻断,当血流完全阻断时,远端温度突降,仪器报警,显示堵塞时间(t堵塞),即血栓形成时间。

　　1.5.3　xq对adp致小鼠肺血栓形成的影响［6-7］取健康雄性icr小鼠60只,随机分为6组,即模型对照组,曲克芦丁组(剂量为96 mg·kg-1·d-1),gb组(剂量为156 mg·kg-1·d-1),xq低、中、高剂量组(剂量分别为78、156、312 mg·kg-1·d-1)。各组均尾静脉给药,容积为10 ml/kg,连续5 d,模型对照组给予等容积的生理盐水。末次给药后15 min,按200 mg/kg尾静脉注射adp溶液,形成急性肺血栓(小鼠呼吸喘促、不能自主活动),记录注射adp后至小鼠恢复自主活动的时间。

　　1.6　统计学方法采用excel软件处理数据。

　　2　结果

　　2.1　各组对大鼠颈动—静脉旁路丝线上血栓形成的影响

　　表1 结果显示：xq中、高剂量组均能显著减轻大鼠动脉血栓的湿、干质量,与模型对照组比较差异有非常显著性意义(p<005或p<001)；曲克芦丁组及gb组也能减轻大鼠动脉血栓的湿、干质量,与模型对照组比较差异有显著性意义(p<005)。表1各组对大鼠颈动—静脉旁路丝线上血栓形成的影响（略）

　　2.2　各组对电流损伤大鼠颈总动脉内膜后血栓形成的影响

　　表2 结果显示：xq 中、高剂量组，曲克芦丁组和gb组均能显著延长血栓形成时间,与模型对照组比较差异有显著性意义(p<005)。表2各组对电流损伤大鼠颈总动脉内膜后
血栓形成的影响（略）

　　2.3　各组对adp致小鼠急性肺血栓形成的影响

　　表3 结果显示：xq 高剂量组及曲克芦丁组对adp诱发的小鼠急性肺血栓形成有抑制作用,均可缩短小鼠的喘促持续时间,与模型对照组比较差异有显著性意义(p<005)。表3各组对adp致小鼠急性肺血栓形成的影响（略）

　　3　讨论

　　大多数心脑血管疾病发生的前提是动脉粥样硬化血栓的形成,血小板的活化在血栓形成过程中发挥重要的作用［8］。血栓形成主要取决于血管内膜受损、血液成分改变及血流异常3个基本要素。血小板活化、黏附、聚集易造成微循环淤滞,还可损伤血管内皮,释放生长因子,促进平滑肌增殖,从而导致动脉粥样硬化［9］。血栓按照发生的部位分为静脉血栓和动脉血栓。静脉血栓主要由于血流缓慢或淤滞,凝血因子聚集而导致血液凝固所引起,富含纤维蛋白和红细胞(红血栓)。颈动—静脉旁路丝线上形成的血栓主要是动脉血栓,主要由于血小板相互聚集所引起,血小板的黏附聚集功能对形成的血栓质量有直接影响,稳定的纤维蛋白和血小板组成白血栓。颈动脉电流损伤法形成的血栓主要是混合血栓,红白血栓两者兼而有之［10-11］。

　　本研究结果显示：xq能显著抑制实验性动—静脉旁路血栓形成,显著降低血栓干、湿质量,延长电击后混合血栓引起的血管堵塞时间,缩短adp诱发急性肺血栓后小鼠恢复自主活动的时间,表明其抗血栓作用可能与抑制血小板聚集有关。复合血栓诱导剂adp能使纤维蛋白原与相应位点结合,并使血小板内贮存的钙释放,进而促进内源性aa释放而致血小板聚集［12］。xq能使血小板的聚集性减弱,降低血浆黏度,增强纤溶系统,使血小板处于解聚集状态,从而抑制血栓的形成。

　　由前期实验研究可知,xq抑制血小板聚集的作用是通过拮抗paf受体而实现的,而且其对adp、aa、col诱导的血小板聚集的半数抑制浓度(ic50)高于银杏内酯b［2］。本实验结果也显示了xq在一定程度上抗血栓形成作用较gb强。xq作为银杏内酯b的衍生物,增加了水溶性,并仍然保持相似的生物活性,作为防治心脑血管疾病的新药具有一定的开发前景。

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