干细胞动员促进心肺复苏后大鼠脑损伤的发展特

随着复苏技术的提高与复苏培训的逐渐普及，已有20%～40%的心搏骤停患者能够恢复自主循环（restoration of spontaneous circulation， ROSC），但是高达50%～70%的ROSC患者却在随后的住院期间死亡[1]，全脑缺血损伤是其死亡的重要原因。
　　针对脑梗死、心肌梗死的一些研究表明，使用G-CSF等干细胞动员剂后，骨髓干细胞从骨髓释放至外周血液循环，然后在一定趋化信号的作用下归巢至损伤部位，通过细胞转化、促进新生血管形成、分泌营养因子等多种可能的作用机制，进而显著改善心、脑功能，减少梗死面积[2-3]。然而，迄今尚未见将自体干细胞动员应用于心肺复苏研究的报道。本研究观察干细胞动员剂G-CSF与AMD3100的应用对复苏后大鼠脑功能的影响，并对其修复组织缺血损伤的机制进行初步探讨。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物、试剂及仪器
　　1.1.1 实验动物 健康雄性清洁级Sprague-Dawley大鼠，体质量 350～450 g，均由广州中医药大学大学实验动物中心提供（许可证号：syxk粤2010-0095）。
　　1.1.2 主要试剂  rhG-CSF（山东齐鲁制药），AMD3100（SIGMA），大鼠VEGF ELISA试剂盒、山羊抗小鼠FITC标记Ig-G（ABCAM），FITC-Dextran（ABCAM）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司）。
　　1.1.3 主要仪器和器械 倒置相差显微镜（T2000U，Nikon），三气培养箱（Forma Scientific），流式细胞仪（Beckman-CoulterFL Becton Dickimson），Quan-iT蛋白检测试剂盒、Qubit荧光分光光度计（Invitrogen）。
　　1.2 实验方法
　　1.2.1 动物模型建立与实验分组 按照笔者之前研究所述方法建立窒息法大鼠心肺复苏动物模型[4]。56只SD大鼠随机（随机数字法）分为4组：G-CSF单独动员组（16只），于ROSC后2 h开始首次皮下注射G-CSF，剂量为50 μg/kg，此后每天1次，连续注射5 d;G-CSF+AMD3100联合动员组（16只），除G-CSF采用上述方法注射外，首次注射G-CSF的同时单次腹腔注射AMD3100，注射剂量为100 μg/kg;单纯复苏组（16只），ROSC后不注射AMD3100及G-CSF，其余术后处理相同;假手术组（8只）进行除复苏以外的所有操作，包括气管插管、动静脉置管等。在复苏后3 d、6 d，三个复苏组各处死8只动物，假手术组处死4只动物，取血液及脑标本。
　　1.2.2 神经功能缺损评分（neural deficit scores，NDS） 各实验组动物于复苏后3 d、6 d各时间点采用NDS神经功能缺损评分量表[5]评价复苏后神经功能。NDS评分标准包括了对觉醒、脑神经反射、运动功能、简单的行为反射等多个方面的检测，得分范围从0～80分，80分为脑功能正常。检测由专人进行。
　　1.2.3 纸带移除实验 复苏后大鼠的感觉运动功能综合评价通过Albertsmeier等[6]介绍的纸带移除实验来完成。在行复苏术的前3天开始对大鼠进行适应性训练，并由专人负责测试并记录时间。在复苏后第3天、第6天进行正式测试、计时，取3次测试结果的均数作为测试成绩。结合Markus等的评分标准，设定180 s为观察终点，达到或超过180 s者均记为180 s。
　　1.2.4 头颅MR检测 在复苏前及复苏后第3天、第6天这3个时间点，使用Philips Intera 1.5T 超导型磁共振成像系统、大鼠专用11 cm环形表面线圈进行脑部MRI成像。在MRI常规序列上观察脑内的信号的演变，使用感兴趣区测量技术检测脑组织信号异常区域信号强度，同时选取同层面的颅面部肌肉测量其信号强度，计算两者的比值作为脑/肌肉信号强度比，取双侧脑/肌肉信号强度比的均数进行统计分析。
　　1.2.5 神经细胞凋亡检测 采用TUNEL法检测脑组织中神经细胞凋亡情况。
　　1.2.6 脑组织VEGF蛋白含量测定 采用双抗体两步夹心ELISA法检测不同时间点大鼠脑组织（海马）VEGF蛋白含量的表达。
　　1.2.7 脑组织毛细血管密度分析 采用Dawson等[7]报道的方法并加以改进。将10% FITC-dextran（相对分子质量 71 000）按照0.2 mL/100 g的剂量弹丸注射至颈动脉，然后快速断头取脑，冰冻切片切冠状面10 μm厚度，在荧光显微镜下观察被FITC标记为绿色的微血管形态，拍照后使用Image pro plus图像分析软件对图片毛细血管密度进行定量分析，将直径小于12 μm的血管定义为毛细血管。每只大鼠取两张切片，每张切片随机取5个400倍高倍视野进行拍照、计算，对各组大鼠脑组织毛细血管密度进行比较。
　　1.3 统计学方法
　　统计分析用SPSS 13.0软件进行，计量资料用均数±标准差 （x±s）表示，与同一对照组比较采用Dunnet’ t检验，组间两两比较采用LSD-t检验，多个样本均数间的比较采用单因素方差分析，两样本率的比较采用χ2检验，每组随时间变化资料均数的比较采用重复测量资料的方差分析。以P< 0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　2.1 NDS评分
　　 在复苏前，各组大鼠NDS评分均为满分80分。复苏后3 d时，G-CSF+AMD3100组大鼠NDS评分显著高于单纯复苏组（P<0.05），G-CSF组与单纯复苏组之间差异无统计学意义;G-CSF+AMD3100组评分有高于G-CSF组的趋势，但差异无统计学意义。复苏后6 d时， G-CSF+AMD3100组与G-CSF组NDS评分均显著高于单纯复苏组（P<0.05）;在G-CSF+AMD3100组与G-CSF组之间则差异仍无统计学意义。见表1。
　　表1 三组大鼠复苏后NDS评分比较（n=16，x±s）
　　Table 1 Comparison of NDS post resuscitation among three groups（n=16，x±s）
　　时间 G-CSF组 G-CSF+AMD3100组 单纯复苏组
　　复苏后 3 d 56.6±11.9 61.4±10.7a 49.9±10.4
　　复苏后 6 d 69.1±6.3a 71.8±7.7a 60.5±7.8
　　 注：与单纯复苏组比较，aP< 0.05
　　
　　2.2 纸带移除实验
　　 复苏前，所有的实验大鼠均能很快将黏性贴纸移除，各组移除时间差异无统计学意义。在ROSC后，各组大鼠均表现出明显的感觉运动功能障碍，移除黏性贴纸的时间明显延长，在ROSC后24 h移除纸带所需时间均超过180 s，此后所需时间逐渐减少。在复苏后3 d时，G-CSF+AMD3100组移除纸带所需时间短于G-CSF组（P<0.05）与单纯复苏组大鼠（P<0.01），G-CSF组比单纯复苏组有降低趋势，但差异无统计学意义。在复苏后6 d，G-CSF+AMD3100组与G-CSF组大鼠移除纸带时间均显著低于单纯复苏组，而在G-CSF+AMD 3100组与G-CSF组之间相比则差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
　　表2 三组大鼠复苏后不同时间纸带移除时间比较（s，n=16，x±s）
　　Table 2 Comparison of adhesive tape removal time post resuscitation among three groups（s，n=16，x±s）
　　时间 G-CSF组 G-CSF+AMD3100组 单纯复苏组
　　复苏后 3 d 118.5±30.4a 85.5±28.9bc 148.1±23.8
　　复苏后 6 d 57.3±19.8a 44.5±18.4a 79.5±21.3
　　 注：与单纯复苏组比较，aP< 0.05，bP< 0.01;与G-CSF组比较，cP< 0.05
　　2.3 头颅MR检测
　　 单纯复苏组在术后3 d 头颅MR损伤表现最为明显，表现为海马区及广泛大脑皮层的广泛高信号改变。在术后第6天时的信号强度明显下降，但仍然高于假手术组大鼠水平。G-CSF组及G-CSF+AMD3100组在复苏术后3 d时的海马区及大脑皮层部位的脑/肌肉信号强度比明显低于单纯复苏组;在复苏后第6天时G-CSF+AMD3100组与G-CSF组大鼠的脑/肌肉信号强度与假手术组大鼠相似，仍显著低于单纯复苏组脑内信号强度。各组大鼠在T1WI及T2WI序列上的海马及/肌肉信号强度与颞叶/肌肉信号强度比值变化趋势相似。见图1。
　　A、B为假手术大鼠脑MRI，分别为矢状位T2WI（A）和横断位T2WI（B）;C为单纯复苏组大鼠复苏后3 d脑MR（T2WI），显示海马区及大脑皮层明显高信号改变;D为G-CSF+AMD3100组大鼠复苏后3 d脑MR（T2WI），显示海马区及皮层区信号强度低于单纯复苏组;E为单纯复苏组大鼠复苏后6 d脑MR（T2WI），显示脑内信号改变仍高于假手术组，此时，G-CSF组与G-CSF+AMD3100组的脑内信号强度与假手术组差异无统计学意义
　　图1 大鼠头颅MR结果
　　Fig 1 Cranial  MR results of rats
　　2.4 脑组织VEGF含量检测
　　 假手术组大鼠脑组织VEGF质量浓度未能测出。复苏后，各组大鼠脑组织VEGF值均逐渐升高，至复苏后6 d达到高峰。在复苏后3 d与6 d，单纯复苏组脑组织VEGF质量浓度显著低于G-CSF+AMD3100组（P<0.05）及G-CSF组（P<0.01）。复苏后3 d时G-CSF+AMD3100组又明显高于G-CSF组（P<0.05），复苏后6 d时两个干细胞动员组之间VEGF质量浓度差异无统计学意义。见表3。
　　表3 三组大鼠复苏后脑组织VEGF质量浓度比较（pg/mL，n=16，x±s）
　　Table 3 Comparison of VEGF in the brain post resuscitation among three groups（pg/mL，n=16，x±s）
　　时间 G-CSF组 G-CSF+AMD3100组 单纯复苏组
　　复苏后 3 d 50.6±13.7a 106.2±23.3bc 23.1±10.2
　　复苏后 6 d 73.9±16.6a 79.9±18.4b 36.2±12.8
　　注：与单纯复苏组比较，aP< 0.05，bP< 0.01;与G-CSF组比较，cP< 0.05
　　2.5 脑组织神经细胞凋亡检测
　　 假手术组大鼠脑组织内罕见神经细胞凋亡。复苏后，各组大鼠在海马及颞叶皮层区凋亡细胞数量明显增多。复苏后3 d时，G-CSF+AMD3100组与G-CSF组大鼠的神经细胞凋亡率低于单纯复苏组（P<0.05），G-CSF+AMD3100组又低于G-CSF组（P<0.05）。在复苏后6 d，G-CSF+AMD3100组与G-CSF组之间神经细胞凋亡率差异无统计学意义，而均显著低于单纯复苏组。见表4。
　表4 三组大鼠复苏后神经细胞凋亡率比较（n=16，x±s）
　　Table 4 Comparison of the apoptosis rate of nerve cells post resuscitation among three groups（n=16，x±s）
　　时间 G-CSF组 G-CSF+AMD3100组 单纯复苏组
　　复苏后 3 d 0.34±0.08a 0.23±0.06bc 0.44±0.09
　　复苏后 6 d 0.18±0.05a 0.16±0.04b 0.29±0.11
　　注：与单纯复苏组比较，aP< 0.05，bP< 0.01;与G-CSG组比较，cP< 0.05
　　2.6  脑组织毛细血管密度分析
　　 单纯复苏组与假手术组的脑组织毛细血管密度相似，复苏后3 d与6 d相比无明显变化。G-CSF+AMD3100联合动员组在复苏后3 d时的脑毛细血管密度显著高于G-CSF单独动员组与单纯复苏组（P<0.05），G-CSF组与单纯复苏组相比差异无统计学意义。复苏后6 d时，G-CSF组脑毛细血管密度较3 d时明显升高，G-CSF+AMD3100组则与3 d时比较无明显变化，两者均显著高于单纯复苏组（P<0.05）。见表5。
　　表5 三组大鼠复苏后脑组织毛细血管密度比较（个/高倍视野，x±s）
　　Table 5 Comparison of the capillary density in the brain post resus citation among three groups（A/HPF，x±s）
　　 时间 G-CSF组 G-CSF+AMD3100组 单纯复苏组
　　复苏后 3 d 301.4±77.3a 351.8±67.9a 250.4±48.0
　　复苏后 6 d 348.4±76.7a 344.1±65.7b 258.1±41.5
　　 注：与单纯复苏组比较，aP< 0.01，bP< 0.05
　　
　　3 讨论
　　 相比外源性干细胞移植，干细胞自体动员具有独特的优势，包括操作简单、易于施行;无需体外培养细胞，避免了中间环节污染;不存在伦理学争议等，是较为理想的促进损伤组织修复的方式。G-CSF为临床常用的干细胞动员剂，一些研究表明G-CSF能够促进心肌梗死、脑梗死时缺血损伤组织的修复。然而，也有部分研究在应，因此有必要探索更快速有效的干细胞动员方案。 AMD3100为人工合成的CXCR4趋化因子受体拮抗剂，可阻断CXCR4与其配体SDF-1的结合，使外周血白细胞及循环CD34+细胞的产生显著增加，是继G-CSF之后又一种被FDA批准用于临床的新型干细胞动员剂，但其动员的干细胞是否能够促进缺血组织损伤的修复，尚少见文献报道。本研究结果表明， AMD3100与G-CSF联合使用比G-CSF单独使用更有利于促进复苏后脑缺血损伤的修复。
　　 心搏骤停复苏后幸存的患者往往遗留程度不等的神经功能缺陷。准确判断神经功能损伤程度，对于病情观察及治疗效果的判断有很大帮助。目前，对复苏后大鼠神经功能缺损的评价多采用NDS量表进行。但是NDS评分操作过程较为复杂，纸带移除实验则是操作简单且能比较精确评价大鼠 感觉运动综合能力的指标。研究表明，从纸带黏上开始至大鼠首次用牙齿碰触纸带的时间主要反映了大脑纹状体部位的功能，从牙齿首次接触纸带至纸带完全移除则反映了大脑皮层的功能[11]。本实验中，NDS评分与纸带移除实验均表明干细胞动员明显改善了复苏后大鼠的神经功能。通过MR影像分析进一步证明了自体干细胞动员能够加快复苏后脑组织损伤的修复，联合使用AMD3100与G-CSF具有更好的治疗效果。
　　 干细胞自体动员促进脑缺血损伤修复的机制是一个复杂的过程，迄今未能完全阐明。研究表明，在脑遭受缺血-再灌注损伤时，神经细胞凋亡是神经功能缺损产生的重要机制之一[12]。Benchoua等[13]在小鼠脑缺血后30 min即在缺血中心区神经元检测到促凋亡因子caspase-1和caspase-8的活化。Vogel等[14]使用过表达caspase抑制剂p35的转基因小鼠进行心肺复苏，发现转基因小鼠的7 d生存率明显高于对照组。由此可见，复苏后早期应用凋亡抑制剂可能有助于神经功能的恢复。本研究发现，复苏后3 d、6 d的神经细胞存在凋亡现象，尤其在对缺血损伤极为敏感的海马区及颞叶皮层部位凋亡细胞明显增多;在自体干细胞有效动员之后，凋亡细胞数量显著减少，干细胞动员对神经细胞凋亡的抑制可能是其发挥治疗效果的重要机制之一。
　　 VEGF的分泌增多是干细胞促进脑组织结构与功能恢复的关键因素之一。Horie等[15]采用脑内注射途径移植人神经干细胞治疗大鼠局灶性脑缺血，发现在移植后早期，干细胞尚未到达损伤区之前即显著改善了血脑屏障完整性并抑制了炎症反应的强度，随后归巢入损伤区的干细胞通过分泌VEGF介导了梗死灶周围新生血管形成，进一步促进神经功能的修复;使用VEGF的特异性拮抗剂阿瓦斯丁可以阻碍新生血管形成，并显著抑制干细胞移植后大鼠的神经功能恢复，这直接说明VEGF介导的新生血管形成是移植的干细胞修复脑缺血损伤的关键环节。然而，在使用干细胞动员剂后，自骨髓动员至外周血的自体干细胞是否通过VEGF的分泌以促进损伤修复，此前少见文献报道。本研究发现，在使用干细胞动员剂后，遭受全脑缺血损伤的脑组织中VEGF蛋白的表达亦显著升高，而未进行干细胞动员的大鼠脑组织中VEGF蛋白仅轻微增加。此外，干细胞自体动员大鼠的脑组织毛细血管密度亦显著高于单纯复苏组大鼠。可见，干细胞自体动员后产生VEGF增加并促进新生血管生成可能是其改善复苏后神经功能的重要机制之一。
　　 综上所述，干细胞自体动员后促进了复苏后大鼠神经功能的恢复，AMD3100与G-CSF联合使用后表现出更好的治疗效果，其对脑损伤的修复作用可能与抑制神经细胞的凋亡、促进VEGF分泌及损伤区新生血管生成有关。
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