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麻芩消咳颗粒对烟熏所致慢性支气管炎小鼠的止咳作用

日期:2023-01-08 阅读量:0 所属栏目:其他医学


  摘    要:

  

  

  目的 探讨麻芩消咳颗粒对烟熏所致慢性支气管炎模型小鼠的止咳作用及其可能机制。方法 60只ICR小鼠建立慢性支气管炎模型后随机分为模型组(B组)、肺宁颗粒3.8 g/kg给药组(C组)以及不同剂量麻芩消咳颗粒0.75、1.50、3.00 g/kg给药组(D1、D2、D3组);另设12只小鼠为对照组(A组)。记录小鼠咳嗽次数和潜伏期,采用ELISA法检测小鼠血清炎症因子含量,HE染色观察肺组织形态学变化,免疫组化检测肺组织Toll样受体4(TLR4)和NF-κB蛋白表达,Western blot法检测核因子相关因子2(Nrf2)和血红素氧合酶1(HO-1)蛋白表达。结果 与B组相比,C、D1、D2、D3组小鼠咳嗽次数减少(P<0.05或P<0.01);C组和D3组小鼠咳嗽潜伏期较B组延长(P<0.05)。与A组相比,B组IL-1β和TNF-α含量以及TLR4、NF-κB、HO-1蛋白表达均增加,Nrf2蛋白表达降低(P<0.01);而C、D1、D2、D3组给药后能有效逆转上述各指标的变化过程(P<0.05或P<0.01)。结论 麻芩消咳颗粒对烟熏所致慢性支气管炎模型小鼠有良好的止咳作用,其机制可能与下调TLR4/NF-κB信号通路以及上调Nrf2/HO-1信号通路有关。

  

  

  关键词:

  

  

  麻芩消咳颗粒 慢性支气管炎

  

  

  Antitussive effect of MaQinXiaoKe granule in mice with smoke-induced chronic bronchitis

  

  

  YU Jiayu DENG Xueyang MA Shiping

  

  

  School of Tranditional Chinese Pharmacy,China Pharmaceutical University;

  

  

  Abstract:

  

  

  Objective To investigate the antitussive effect and underlying mechanism of MaQinXiaoKe granule in mice with smoke-induced chronic bronchitis.Methods The chronic bronchitis model was established in 60 ICR mice,which then equally randomized into five groups.Another 12 mice were taken as the blank controls(group A).The mice in groups of B,C and D1,D2,D3 were pretreated with normal saline,FeiNing granule 3.8 g/kg and different concentrations of MaQinXiaoKe granule 0.75,1.50,3.00 g/kg,respectively.The attack and incubation period of cough were recorded.The contents of inflammatory factors in serum were determined by ELISA.The morphological change of lung tissues was observed by HE staining.The protein expressions of TLR4 and NF-κB in the lung tissues were measured by immunohistochemistry.The protein expressions of Nrf2 and HO-1 were detected by Western blot.Results Compared with group B,the times of cough was decreased in groups of C,D1,D2 and D3(P<0.05 or P<0.01).The incubation period of cough in groups of C and D3 was longer than that in group B(P<0.05).Compared with group A,the contents of IL-1β and TNF-α and the protein expressions of TLR4,NF-κB and HO-1 were increased,and the protein expression of Nrf2 was decreased in group B(P<0.01),while which were significantly reversed after pretreated with FeiNing granule and MaQinXiaoKe granule in groups of C,D1,D2 and D3(P<0.05 or P<0.01).Conclusion MaQinXiaoKe granule could have a good antitussive effect in mice with smoke-induced chronic bronchitis,which may be related to the downregulation of TLR4/NF-κB signaling pathway and the upregulation of Nrf2/HO-1 signaling pathway.

  

  

  Keyword:

  

  

  MaQinXiaoKe granule; Chronic bronchitis;

  

  

  慢性支气管炎是慢性阻塞性肺疾病中一种常见但多变的慢性非特异性炎症,发病率高,病情易反复发作,临床表现为咳嗽、咳痰、肺功能下降等,引发下呼吸道疾病,是呼吸相关死亡的危险因素之一[1],其中吸烟是慢性支气管炎的主要致病因素[2]。在中医学方面,慢性支气管炎属于“咳嗽”、“痰饮”范畴,故有效止咳平喘从而防治慢性支气管炎显得尤为重要。麻芩消咳颗粒是由麻黄、桑白皮、金银花、黄芩等中药提取加工制成的颗粒剂,能止咳平喘、清肺化痰,临床常用于急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作属痰热郁肺证的治疗。本研究建立了香烟烟熏所致的慢性支气管炎模型,旨在考察麻芩消咳颗粒对小鼠慢性支气管炎模型的止咳作用、量效关系并探究其可能机制。

  

  

  材料与方法

  

  

  一、材料

  

  

  1.实验动物

  

  

  72只SPF级雄性ICR小鼠,体重18~20 g,购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场[实验动物许可证号:SCXK(苏)2017-0001]。饲养温度(24±2)℃,相对湿度50%~60%,昼夜交替12 h,1周后用于实验。

  

  

  2.主要药物和试剂

  

  

  麻芩消咳颗粒(亿帆制药,批号190602);肺宁颗粒(修正药业集团股份有限公司,批号180365)。IL-1β 和TNF-α ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司,货号E-EL-R0012c和E-EL-R2856c);Toll样受体4(TLR4)抗体(Proteintech公司,货号19811-1-AP);NF-κB抗体(CST公司,货号8242s);核因子相关因子2(Nrf2)抗体(Proteintech公司,货号16396-1-AP);血红素氧合酶1(HO-1)抗体(Proteintech公司,货号10701-1-AP);其余试剂均为国产分析纯试剂。

  

  

  3.仪器

  

  

  冷冻离心机(Eppendorf公司);-80℃超低温冰箱、SN3001全波长多功能酶标仪(美国Thermo公司);TE124S精密电子天平(Sartorius公司)。

  

  

  二、方法

  

  

  1.动物分组及慢性支气管炎模型建立

  

  

  适应性喂养1周后,按体重将72只ICR小鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、肺宁颗粒3.8 g/kg给药组(C组)以及不同剂量麻芩消咳颗粒0.75、1.50、3.00 g/kg给药组(D1、D2、D3组),每组12只小鼠。C、D1、D2、D3组按10 mL/kg体积灌胃相应药物,A组和B组则给予等体积的生理盐水。参照文献[3]方法,建立慢性支气管炎小鼠模型。在小鼠分组给药后40 min,将小鼠放入体积为10~20 m3自制透明烟熏装置中,下留有进烟口,上留有出气口。将香烟过滤嘴去掉,用100 mL注射器将香烟烟雾注入烟熏装置中,使烟雾浓度在2 min内达到4%,烟熏30 min。前10 d,每天熏2次,每次间隔4 h;10 d后,每天熏1次,制备香烟烟熏所致慢性支气管炎小鼠模型。

  

  

  2.咳嗽潜伏期和次数

  

  

  末次给药40 min后将小鼠放入烟熏装置,去掉香烟过滤嘴后用100 mL注射器将香烟烟雾注入烟熏装置中,观察并记录小鼠第1次咳嗽潜伏期和3 min内咳嗽次数。

  

  

  3. ELISA法测定血清中炎症因子含量

  

  

  每组小鼠摘眼球取血,血液静置30 min后,3000 r/min离心15 min,小心吸取上清液,按ELISA试剂盒说明书步骤检测血清IL-1β和TNF-α含量。

  

  

  4.肺组织HE染色

  

  

  小鼠取血处死,统一取左肺,置于10%中性甲醛溶液中固定,制作石蜡切片后,HE染色观察肺组织病理学变化。

  

  

  5.免疫组化检测炎症相关蛋白表达

  

  

  小鼠取血处死,迅速取左肺,置于10%中性甲醛溶液中固定,制作石蜡切片,免疫组化检测肺组织中TLR4和NF-κB蛋白表达变化。

  

  

  6. Western blot法检测氧化应激相关蛋白表达

  

  

  肺组织加入蛋白裂解液,于冰上充分匀浆,提取总蛋白。用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白后转移至PVDF膜上,5%脱脂牛奶室温封闭2 h,4℃孵育一抗(兔抗Nrf2、HO-1抗体)过夜,TBST洗后室温孵育二抗2 h,再用TBST清洗,滴加ECL,用凝胶成像系统曝光。以β-actin为内参,检测肺组织中Nrf2和HO-1蛋白表达。

  

  

  三、统计学处理

  

  

  采用Graphpad Prism 5软件进行统计学分析。计量数据用均数±标准差(x¯±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析;P<0.05为差异有统计学意义。

  

  

  结 果

  

  

  一、咳嗽指征

  

  

  与B组相比,C、D1、D2、D3组小鼠的咳嗽指征得到改善,3 min内咳嗽次数减少(P<0.05或P<0.01),且D1、D2、D3组小鼠咳嗽次数的减少呈剂量依赖性(P<0.05);此外,C组和D3组小鼠咳嗽潜伏期较B组延长(P<0.05)(图1)。

  

  

  二、血清炎症因子含量

  

  

  B组血清中IL-1β和TNF-α含量高于A组(P<0.01);而C、D1、D2、D3组给药后IL-1β和TNF-α含量较B组降低(P<0.05或P<0.01)(图2)。

  

  

  三、肺组织病理变化

  

  

  A组肺组织结构基本正常,肺泡壁和肺泡腔无明显充血扩张,未见炎性细胞浸润,支气管上皮细胞排列整齐,黏膜结构完整。烟熏造模后,B组小鼠肺组织和支气管发生明显病变,肺泡壁和支气管壁均出现大量炎性细胞浸润,肺泡腔破损,支气管上皮杯状细胞增生,出现气管阻塞现象;而C、D1、D2、D3组给药后均明显改善肺组织病理变化。(见封三图3)

  

  

  四、炎症相关蛋白表达

  

  

  A组小鼠肺组织中TLR4阳性表达很弱,B组TLR4阳性细胞数明显增多,其蛋白表达较A组升高(P<0.01);而C、D1、D2、D3组均降低了香烟烟熏刺激引起的TLR4高表达(P<0.05或P<0.01)。B组NF-κB蛋白表达A组升高(P<0.01),入核明显增多;而C、D1、D2、D3组给药后NF-κB蛋白表达较B组降低(P<0.05或P<0.01),入核减少。(见封三图4-5,图6)

  

  

  五、氧化应激相关蛋白表达

  

  

  与A组相比,B组小鼠肺组织中Nrf2蛋白表达降低,HO-1蛋白表达升高(P<0.01);与B组相比,C组和D2组给药后Nrf2蛋白表达升高,HO-1蛋白表达降低(P<0.05或P<0.01)(图7)。

  

  

  讨 论

  

  

  慢性支气管炎是一种常见的呼吸系统疾病,其病程长、易反复且治疗难度大,临床表现以咳嗽、咳痰等为主,常常在过度疲劳、吸烟、感冒等情况下发病,不仅干扰患者正常生活,还增加家庭和社会的经济负担[4]。目前,慢性支气管炎的发病率逐年增加,寻求有效的治疗途径愈发紧要。

  

  

  慢性支气管炎可归属于中医的“咳嗽”、“喘证”、“痰饮”范畴,痰湿阻肺为其病机关键所在。麻芩消咳颗粒由15味道地药材组成,组分源自我国清肺定喘咳的经典名方《麻杏石甘汤》,有效治疗咳、痰、喘。麻黄味苦,性温,归肺、膀胱经,主治咳、痰、喘,抗炎镇痛;桑白皮味甘,性寒,归肺经,主治肺热咳喘;两者合为君药,宣肺肃降、止咳定喘。金银花味甘,性寒,归肺、心、胃经,有清热解毒之功效,主治咽喉炎症;黄芩味苦,性寒,归肺、胆、脾经,能够清热燥湿;石膏味甘、辛,性大寒,归肺、胃经,善清肺经实热,常用于治疗肺热咳嗽;百蕊草味辛、微苦,性寒,归肺、脾、肾经,清热利湿解毒;以金银花、黄芩、石膏、百蕊草为臣药,清热泄肺,定喘止咳。苦杏仁味苦,性微温,归肺、小肠经,主治咳、痰、喘,有抗炎、镇痛的功效;紫苏子味辛,性温,归肺、大肠经,具有降气、消痰、平喘之效;半夏味辛,性温,归脾、胃、肺经,用于燥湿化痰;浙贝母味苦,性寒,归肺、心经,清热化痰,主治风热咳嗽;葶苈子味苦、辛,性大寒,归肺、膀胱经,能泻肺平喘;款冬花味辛、微苦,性温,归肺经,主治咳嗽气喘;地龙味咸,性寒,归肺、脾、膀胱经,能清热平喘;以苦杏仁、紫苏子、半夏、浙贝母、葶苈子、款冬花、地龙为佐药,主司化痰、降气逆、畅通气道。白果味甘、苦、涩,性平,归肺、肾经,有敛肺定喘之功效,治疗咳嗽痰多;甘草味甘,性平,归心、肺、脾、胃经,可以清热解毒、祛痰止咳;以白果和甘草为使,用以调和诸药,能祛痰止咳、敛肺定喘。本研究结果表明,麻芩消咳颗粒能够显著延长香烟烟熏所致的慢性支气管炎小鼠的咳嗽潜伏期,减少咳嗽次数,具有良好的止咳作用。

  

  

  目前认为,空气污染、微生物感染和免疫力下降等因素导致的气管、支气管黏膜以及肺部的慢性炎症是慢性支气管炎主要的发病原因[5-6]。研究发现,慢性支气管炎患者体内促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α等)含量升高[7],在急性加重期进一步增加,并易诱发下呼吸道感染,导致咳嗽加重、呼吸困难[8],其病理特征表现为支气管壁杯状细胞的增殖、炎性细胞浸润、气道黏液堵塞等[9]。本研究结果示,烟熏造模后B组小鼠血清中IL-1β和TNF-α含量升高,肺组织发生明显病变,而各给药组起到良好的改善作用,表明麻芩消咳颗粒可能通过抑制慢性支气管炎引起的炎症因子释放,预防和缓解肺损伤来发挥止咳作用。另外,近年来研究发现,慢性支气管炎患者体内TLR4和NF-κB异常活化[10-11]。TLR4被激活后可通过一系列级联反应激活NF-κB,使其入核,结合促炎基因启动子,增强其基因表达,释放细胞因子,造成炎性损伤。本研究发现,B组小鼠肺组织中TLR4和入核NF-κB的蛋白表达明显增加,给予麻芩消咳颗粒后减少了这种现象发生。因此,麻芩消咳颗粒可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,从而减少炎症因子的表达,缓解肺组织损伤,进而起到良好的止咳作用。

  

  

  此外,氧化应激在慢性支气管炎发生中的作用也颇受重视[12-14]。香烟烟雾中含有大量有害物质,如氧自由基以及过氧化氢等,吸烟刺激炎症因子的产生,氧化-抗氧化平衡被破坏,导致肺损伤。Nrf2是一种调控细胞损伤的转录因子,被激活后可以调控下游抗氧化蛋白如HO-1的表达[15]。研究表明,激活Nrf2通路可以减少氧化应激,从而对烟熏所致肺损伤发挥保护作用[16]。另外,慢性阻塞性肺疾病患者的肺组织和肺泡巨噬细胞表现出Nrf2激活的减少,慢性烟熏造模后,敲除Nrf2的小鼠会出现更严重的肺泡损伤、氧化应激损伤、凋亡和炎症,而激活Nrf2可减少香烟烟雾暴露引起的肺组织病变[17]。本研究发现,香烟烟熏所致慢性支气管炎小鼠肺组织中Nrf2蛋白表达显著降低,而给予麻芩消咳颗粒则明显逆转了这种现象。HO-1是一种应激蛋白,具有抗氧化、抗炎、抑制血小板聚集等作用,生理状态时在体内低表达,而机体受到外界因素(如细胞因子、炎症因子、应激、氧化剂等)刺激后可大量表达[18]。本研究发现,B组小鼠肺组织中HO-1蛋白表达显著升高,而给予肺宁颗粒和麻芩消咳颗粒后HO-1蛋白表达水平有所下降,推测麻芩消咳颗粒本身具有良好的抗氧化能力,可调节氧化-抗氧化失衡,从而协同HO-1共同发挥抗氧化作用以对抗烟熏所致的肺损伤。由此推测,麻芩消咳颗粒还能通过激活Nrf2表达,并协同HO-1发挥抗氧化应激作用,从而缓解肺损伤,达到止咳的效果。

  

  

  总之,本研究结果显示,麻芩消咳颗粒中剂量(即临床剂量)即可对香烟烟熏诱导的慢性支气管炎具有良好的止咳作用,其作用机制可能与下调TLR4/NF-κB炎症信号通路,激活Nrf2并协同HO-1抗氧化应激,降低肺组织和血液中炎症因子含量,从而缓解肺损伤有关。

  

  

  参考文献

  

  

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