阿霉素对人乳腺癌细胞MCF7表达KIF4A的抑制作用

【摘要】目的：探讨阿霉素对人乳腺癌细胞MCF7表达KIF4A的影响。方法：用Western blotting方法检测阿霉素处理MCF7细胞后不同时间该细胞表达的KIF4A蛋白;用不同浓度的阿霉素处理MCF7细胞96 h后,检测KIF4A蛋白，并进行衰老相关半乳糖苷酶染色。结果：与未用阿霉素处理的MCF7细胞相比，阿霉素处理的MCF7细胞表达KIF4A蛋白降低;衰老相关半乳糖苷酶染色率由5%提高到42%，染色阳性的细胞形态亦呈衰老样变。结论：阿霉素处理MCF7细胞可使KIF4A蛋白表达水平降低，KIF4A蛋白表达降低与阿霉素引起MCF7细胞衰老的关系有待进一步研究。

　　【关键词】 KIF4A蛋白; 阿霉素; 细胞衰老; MCF7细胞

　　Inhibitory effect of adriamycin on expression of KIF4A in human breastcancer cells MCF7　WANG Lu, WU Huijuan, XU Ning, WANG Congyang, HE Ze, SHEN Chuanlu(Department of Pathophysiology and Pathology, School of Basic Medical Sciences, Southeast University, Nanjing 210009, China)

　　[Abstract] Objective: To study the effects of adriamycin on expression of KIF4A protein in MCF7 cells. Methods: During different periods of time after the cells treated with adriamycin, the expression level of KIF4A protein was detected by Western blotting. Then, 96 h after the MCF7 cells were treated with different concentrations of adriamycin, the expression of KIF4A protein was monitored by Western blotting, and at the same time the senescent MCF7 cells were measured by using the method of senescence associatedβgalactosidase stain. Results: Compared with the untreated MCF7 cells, the expression level of KIF4A protein in the MCF7 cells treated with adriamycin was significantly decreased. The MCF7cells positive for the senescence associatedβgalactosidase marker were increased from 5% to 42% by 1 μmol•L-1 of adriamycin. Meantime, the positive staining MCF7 cells exhibited a characteristic enlarged and flattened morphology. Conclusion: The expression of KIF4A protein decreases in MCF7 cells treated with adriamycin. The relationship between the reduced expression of KIF4A and the cellular senescence remains to be further elucidated.

　　[Key words] KIF4A protein; adriamycin; cellular senescence; MCF7 cells

　　细胞衰老是指细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态，是正常细胞的必然归宿[1]。随着细胞衰老，许多基因的表达发生变化，包括促进生长的相关因子低表达、抑制生长的相关因子过表达以及下游途径的干预[2];同时端粒和端粒酶也发生改变[3]。肿瘤细胞往往具有衰老障碍而表现出无限增殖，因此，深入研究肿瘤细胞衰老的分子机制将为肿瘤的有效防治提供线索。

　　阿霉素是一类临床常用的抗肿瘤药物，虽然人们已知阿霉素可与 DNA发生交叉联结，抑制 DNA合成，对 RNA和蛋白的合成也有一定的抑制作用，但其治疗肿瘤的机制仍不完全清楚。 Elmore等[4]报道阿霉素能导致MCF7细胞衰老，但其机制尚有待研究。本研究发现阿霉素能抑制 MCF7细胞蛋白表达。

　　1 材料与方法

　　1.1 细胞培养及处理

　　用含10%灭活胎牛血清、100 U•ml-1青霉素、100 U•ml-1链霉素和2 mmol•L-1谷氨酰胺的高糖DMEM完全培养基于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养MCF7细胞，每2～3天用0.125%胰蛋白酶/0.5% EDTA混合液传代。

　　1.2 Western blotting

　　接种1.25×105的MCF7细胞于35 mm培养皿。次日每皿用1 μmol•L-1的阿霉素处理细胞2 h。用10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中继续培养。分别于阿霉素处理后第12、24、48、72、96小时收集蛋白。另外，分别用0、0.05、0.1、0.5、1、2 μmol•L-1浓度的阿霉素处理MCF7细胞2 h，96 h后收集蛋白,用Bradford方法测定其蛋白浓度。进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和转膜，用抗KIF4A抗体(Santa Cruz公司)检测KIF4A蛋白，同时用抗βtubulin(Cell Signaling公司)蛋白作为内参对照。用化学发光法显示各种靶蛋白的表达水平。用ImagePro Plus 6.0软件对蛋白条带进行光密度分析后，将各蛋白条带的光密度值用于下列公式计算KIF4A蛋白表达抑制率：KIF4A蛋白表达抑制率(%)=[OD(未处理组KIF4A蛋白)/OD(β微管蛋白)-OD(处理组KIF4A蛋白)/OD(β微管蛋白)]/OD(未处理组KIF4A蛋白)/OD(β微管蛋白)×100%。

　　1.3 衰老相关半乳糖苷酶染色(senescence associatedβgalactosidase stain, SAβGal) 衰老相关半乳糖苷酶染色方法是一种用于检测细胞衰老的最常用方法[5],其主要步骤是：接种1.25×105的MCF7细胞于35 mm培养皿。次日每皿用1 μmol•L-1的阿霉素处理细胞2 h。用10%胎牛血清的DMEM于37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中继续培养。96 h后用PBS清洗细胞，3.7%甲醇固定，PBS再清洗，加入染色液(1 mg•ml-1 Xgal，5 mmol•L-1 K3Fe[CN]6，5 mmol•L-1 K4Fe[CN]6，150 mmol•L-1NaCl及2 mmol•L-1 MgCl2，40 mmol•L-1 citric acidNa2HPO4 pH6.0)。37 ℃避光孵育16 h，染色结束后用PBS清洗细胞，倒置显微镜下观察衰老细胞，计算衰老染色率(染色阳性细胞数/计数的总细胞数)。

　　2 结 果

　　2.1 阿霉素处理后MCF7细胞表达KIF4A蛋白的动态变化 用1 μmol•L-1阿霉素处理MCF7细胞2 h,在处理后第12、24和48小时，阿霉素虽可抑制KIF4A蛋白表达，但其抑制作用并不十分明显，KIF4A蛋白与β微管蛋白光密度比值分析显示，其表达的抑制率为20%～35%;而在第72和96小时，阿霉素处理的MCF7细胞表达KIF4A显著降低，其表达的抑制率均高达65%以上(尤以第96小时最明显)见图1。

　　2.2 不同浓度阿霉素对MCF7细胞KIF4A蛋白表达的作用 分别用0、0.05、0.1、0.5、1和2 μmol•L-1浓度的阿霉素处理MCF7细胞2 h，96 h后，虽然0.1 μmol•L-1以下浓度的阿霉素对KIF4A蛋白表达无明显影响，但0.5 μmol•L-1及以上浓度的阿霉素均可显著降低KIF4A蛋白水平，KIF4A蛋白与β微管蛋白光密度比值分析显示其表达的抑制率均高达50%以上，并且呈浓度依赖性(图2)。图2 不同浓度阿霉素对MCF7细胞KIF4A蛋白表达的作用

　　2.3 阿霉素对MCF7细胞衰老的作用

　　用1μmol•L-1 阿霉素处理或未处理MCF7细胞2 h，96 h后进行衰老相关半乳糖苷酶染色。染色阳性的细胞核周边出现蓝染区域，细胞呈衰老样变：体积变大，扁平，胞浆颗粒增多，富含液泡。 结果显示经阿霉素处理的MCF7细胞的染色率显著增加，高达42%;相反，未处理的细胞仅5%。结果提示1μmol•L-1阿霉素可显著诱导人乳腺癌细胞MCF7衰老。见图3。

　　3 讨 论

　　本研究用阿霉素处理培养的MCF7细胞，动态观察了处理后不同时间该细胞KIF4A蛋白水平;用不同浓度的阿霉素处理MCF7细胞，96 h后观察了KIF4A蛋白表达和细胞衰老率，发现阿霉素处理的MCF7细胞表达KIF4A蛋白降低，呈现浓度依赖性，并且阿霉素促使MCF7细胞衰老。

　　阿霉素抑制KIF4A蛋白表达与阿霉素促使MCF7细胞衰老的关系尚不清楚。KIF4A属于KIF4家族，是一类以氨基末端为驱动结构域的马达蛋白[6]，在细胞分裂，特别是纺锤体形成中具有重要作用[7-8]。KIF4A能结合并灭活PARP1蛋白，导致发育过程中神经细胞死亡[9]。在KIF4A敲除小鼠，细胞分裂异常，导致非整倍体形成，并且DNA损伤应答途径异常，细胞对电离辐射的敏感性增强，DNA损伤加重[10]。与本研究相似，在H2O2诱导人成纤维细胞衰老中，KIF4A表达降低[11]。抑制KIF4A表达从而诱导DNA损伤应答途径(DDR)激活，是否是阿霉素和(或)H2O2诱导细胞衰老的机制[12]有待深入研究。

　　肿瘤细胞往往具有衰老障碍而表现出无限增殖;相反，通过细胞衰老肿瘤可以停滞在良性阶段而不转化为恶性肿瘤。近来，一些研究表明，除细胞凋亡之外，细胞衰老也是化疗和放疗治疗肿瘤的主要方式[13]。很多时候，肿瘤对化疗药物诱导的细胞凋亡产生耐药性;比较而言，肿瘤细胞更难以对化疗药物诱导细胞衰老产生耐药性，因此，在耐药性肿瘤的治疗中细胞衰老常常是抑制肿瘤生长的最主要机制。另外，与高剂量的化疗药物导致细胞凋亡不同，低剂量的化疗药物常常诱导细胞衰老，所以通过诱导肿瘤细胞衰老以治疗肿瘤将有可能降低药物的毒副作用。如果本研究的后续实验能证实KIF4A确实在肿瘤细胞衰老过程中具有重要作用，这将可能为肿瘤的有效防治提供新的靶点。

　　【参考文献】

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　　[4] ELMORE L W, REHDER C W, DI X, et al. Adriamycin-induced senescence in breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction[J]. J Biol Chem, 2002,277(38):3550935515.

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　　[8] LEE Y M, KIM W. Kinesin superfamily protein member 4(KIF4) is localized to midzone and midbody in dividing cells[J]. Exp Mol Med, 2004,36(1):9397.

　　[9] MIDORIKAWA R, TAKEI Y, HIROKAWA N. KIF4 motor regulates activitydependent neuronal survival by suppressing PARP1 enzymatic activity[J]. Cell, 2006,125(2):371383.

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