β半乳糖苷酶供体片段定点突变、表达、纯化与

作者：李黄金,陈伟,赵林,黄志健

【摘要】 目的 构建含εnh2标记位点的克隆酶供体免疫分析(cedia)系统供体片段。方法 从大肠杆菌基因组克隆β半乳糖苷酶(βgal)的α片段基因，通过定点突变在原精氨酸位点处引入赖氨酸突变，与硫氧环蛋白(trx)融合表达后与δα片段进行酶学互补活性分析。结果 克隆的α片段为βgal n端1-56多肽片段，定点突变得r14k、r53k和r14k/r53k等3种突变体。融合表达产物经亲和层析后纯度达到90%以上，且4种α片段的纯度基本一致。各纯化产物显示了不同的酶学互补活性，其中r53k突变体的活性远高于r14k和r14k/r53k的，且与野生型α片段的基本一致。结论 α片段r53k突变体具有作为cedia系统含内部标记位点供体的潜力。

【关键词】 β半乳糖苷酶;供体;标记位点;互补

　　(school of life sciences and biopharmaceutics,guangdong pharmaceutical college,guangzhou,guangdong 510006,china)abstract:objective to introduce an internal εnh2 for conjugated analyte into donor of cloned enzyme donor immunoassay ( cedia ).methods α gene of βgalactosidase was cloned from escherichia coli,and introduced lysine code by sitespecific mutagenesis. α genes were fused to trx tag and expressed under the control of promoter t7 in e. coli origami (de3),then screened by complementation assay with δα fragment after s an αgene coding 156 aa was cloned,then three mutants r14k、r53k and r14k/r53k were obtained by changing arginine into lysine. the overexpression products of αgenes were purified to a purity over 90%. of three mutants,r53k showed the highest activity,which was identical to native α fragment’s and far higher than other mutants’.conclusion mutant r53k could be potentially used as a donor containing internal εnh2 for cedia.

　　key words: βgalactosidase; donor; conjugation site; complementation

　　克隆酶供体免疫分析(cloned enzyme donor immunoassay,cedia)技术是一种基于β半乳糖苷酶(βgal)α互补的均相酶免疫分析技术[1]，由于特异性强、灵敏度高、且操作简单而快速，目前已广泛应用于临床检验、药物滥用筛查、食品有害残留检测与环境污染监控等方面[2，6]。ia系统由βgal酶供体(α片段)、受体(δα片段)、标记抗原(待测物)和抗体组成，抗体与标记抗原的结合可导致βgal互补活性的下降，而当样品中含有待测抗原时，待测抗原与标记抗原竞争结合抗体，并最终表现为样品中的抗原浓度与酶活性呈正相关。由于对受体片段的任何化学修饰均会导致其互补活性的丧失[7]，所以抗原只能标记于较小的供体片段。εnh2是最具标记活性的基团之一[8]，但天然供体片段中缺乏含εnh2的赖氨酸。本文报道了一种含εnh2基的、具有作为cedia供体片段潜力的βgal α片段突变体。

　 　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　大肠杆菌dh5α和bl21(de3)由本室保存，大肠杆菌origami(de3)和表达载体pet32a 为novagen公司产品;taq酶、限制性内切酶、t4 dna连接酶、dna lader和蛋白质marker等均为大连宝生物工程有限公司产品;pcr产物回收试剂盒和dna凝胶回收试剂盒购自百泰克生物技术有限公司;histrap ff柱(1 ml)为ge公司产品;bca试剂盒为广州美津生物技术有限公司产品;咪唑(分析纯)为广州化学试剂厂产品;tanon4100全自动数码凝胶图像分析系统为上海天能科技有限公司产品。

　　1.2 引物设计与合成

　　α片段克隆与突变用上游引物分别为αf和αfm，αf的序列为5′tagccatgggttcactgg ccgtcgttttac3′，αfm的序列为5′tag ccatgggttcactggccgtcgttttacaaaagcgtg actgggaaaac3′， 其中下划线处为ncoⅰ位点;α片段克隆与突变用下游引物分别为αr和αrm，αr的序列为5′tagggatccttaatgatg atgatgatgatgattcaggctgcgcaactgttg3′， αrm的序列为5′tagggatccttaatgatg atgatgatgatgattcaggctcttcaactgttggga agggcg3′， 其中前后下划线分别为bamhⅰ位点和his6标签序列。所有引物委托上海invitrogen公司合成。

　　1.3 α片段pcr扩增、突变与克隆

　　按常规方法制备大肠杆菌bl(de3)基因组dna，并以其为模板，用αf和αr引物对扩增α片段基因，以αfm和αr、αf和αrm、αfm和αrm引物对扩增分别得r14k、r53k和r14k/r53k等3种α突变体基因。pcr反应参数为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共25个循环，72 ℃ 7 min。扩增产物用pcr产物回收试剂盒按厂家说明纯化，经ncoⅰ和bamhⅰ双酶切后按常规方法克隆于pet32a相同位点，得α片段及其突变体的融合表达载体。

　　1.4 dna序列分析

　　委托深圳华大基因有限公司进行。

　　1.5 表达诱导

　　工程菌接种于质量浓度为50 μg/ml氨苄青霉素的lb培养基，37 ℃振荡培养过夜，按1%(体积分数)比例转接新鲜lb培养基，继续培养2.5 h，加入iptg至终浓度1 mmol/l进行表达诱导，共诱导4 h。6 000 r/min离心5 min收集菌体。

　　1.6 表达产物分离纯化

　　经表达诱导所获菌体按10%(ρ)悬浮于含500 mmol/l nacl的20 mmol/l磷酸钠缓冲液(ph7.5)，于冰浴中以300 w输出功率间歇式超声破碎10 min，12 000 r/min离心10 min。所获上清以histrap ff柱参照厂家说明进一步纯化，其中平衡和洗脱用缓冲液分别为含20 mmol/l和300 mmol/l咪唑的上述破菌缓冲液。

　　1.7 蛋白质sdspage与凝胶扫描分析

　　按照常规方法进行各种样品的sdspage，分离胶质量浓度为12%。菌体培养物或纯化过程中的蛋白样品以2倍上样缓冲液煮沸5 min，12 000 r/min离心后取上清电泳。电泳所获凝胶以tanon4100全自动数码凝胶图像分析系统按厂家说明进行拍照和表达水平或蛋白质纯度分析。

　　1.8 蛋白质浓度测定

　　采用bca试剂盒按厂家说明进行，以小牛血清白蛋白为标准品。

　　1.9 △α片段样品制备

　　取大肠杆dh5α(lacz m15)甘油种按1%(体积分数)接种量接种于200 ml lb培养基，37 ℃振荡培养过夜，离心收菌，按“1.6” 所述方法破碎菌体，12 000 r/min离心10 min，收集上清，测定总蛋白质浓度后4 ℃保存备用。

　　1.10 βgal酶学互补活性分析

　　参照henderson等方法[1]进行。向96孔酶标板每孔加入100 μl质量浓度为1.25 mg/ml邻硝基苯基d半乳糖吡喃糖苷(onpg)的pm缓冲液(1 mmol/l mgso4、质量分数0.05%吐温20的0.1 mol/l磷酸钠缓冲液，ph7.6)，加入△α片段样品至终质量浓度50 μg/ml，加入α片段样品至终质量浓度1 μg/ml，37 ℃保温，分别保温至20、40、60、80、100、120、140、160 min后加入0.5 mol/l naco3 50 μl以终止反应，待全部反应终止后以酶标仪测定a410。每个处理共设3个重复，以a410对时间作坐标图。

　 　2 结果

　　2.1 βgal α基因克隆与突变

　　以大肠杆菌bl21(de3)株基因组dna为模板扩增βgal n端1～56肽段的编码序列即得α基因，通过pcr的上、下游引物分别将α片段的第14位和第53位的精氨酸突变成赖氨酸，共得r14k、r53k和r14k/r53k等3种突变体(图1)，扩增片段大小与理论序列一致。野生型和突变型α基因克隆于硫氧环蛋白(trx)融合表达载体pet32a后进行序列分析，结果表明，所获野生型α基因及其突变体基因序列与理论序列完全一致(结果未呈)。

　　2.2 βgal α基因表达与纯化

　　野生型βgal α及其突变体基因在大肠杆菌origami(de3)宿主株表达诱导后的sdspage结果如图2所示，在相对分子质量为2 400 处均出现表达诱导产物，大小与理论值一致，表达水平约为30%。

　　表达产物分离纯化结果如图3所示。结果显示，表达产物主要存在于破菌后的上清中，因此表达产物主要以可溶蛋白存在。经ni柱亲和层析一步纯化后纯度可达90%以上，且4种α片段的纯度基本一致。

　　2.3 βgal酶互补活性分析

　　α片段及其突变体与δα(m15突变体)的酶学互补活性分析结果如图4所示。r53k突变体的a410绝对值和单位时间内的增量均远高于r14k和r14k/r53k的，且与野生型α片段的相似。由于供试的各种α片段纯度相似,且蛋白浓度一致，因此，结果表明r53k突变体拥有与野生α片段相似的互补活性。

　　 3 讨论

　　cedia是一种高通量、高灵敏度的均相酶免疫分析手段，大肠杆菌βgal的α互补特性以及抗原与抗体的结合反应是其分析测定的生化基础。由于cedia是基于标记抗原与抗体的结合导致酶学活性下降而设计的，因此参与反应的2个互补片段必须拥有高的互补活性。welply等[9]通过重叠肽技术发现了众多的βgal供体类型，这些片段长短不一，从数十个到百多个氨基酸残基不等，均拥有与βgal m15突变体(δα11-41)互补的活性。本研究选取其中具有较高互补活性的α156片段以基因工程手段进行制备。由于该片段分子量较小，不利于高效表达，所以采用了与硫氧还蛋白(trx)融合表达的策略。相关酶学互补活性分析的结果表明，此类融合表达产物具有较高的互补活性，因此可直接用于α片段及其突变体互补活性的比较研究。

　　在cedia系统中，待测抗原是标记于供体片段的，其原因是现有的化学修饰手段均会破坏受体片段的互补活性。蛋白质或多肽的修饰或化学偶联策略主要是通过—nh2基和—cooh基间或2个—sh基间形成共价键[8]，其中具有较高反应活性的nh2基必须是n末端的自由nh2基或片段内部的εnh2基，即赖氨酸的nh2基。对βgalα片段n端nh2基或c末端cooh基的任何化学修饰均会导致互补活性的丧失[1]，而内部又缺乏ε—nh2基、—cooh基或—sh基，因此，野生型α片段缺乏合适的抗原标记位点。采用定点突变的方法向α片段引入赖氨酸，并且选取理化特性相近的精氨酸位点作为置换点，以减少点突变给活性带来的不利影响。通过pcr引物突变的方法构建了r14k和r53k单突变体和r14k/r53k双突变体，相关的酶学互补活性研究结果表明，仅r53k突变体具有与野生型α片段相似的互补活性，表明arg14可能是片段互补中的关键氨基酸，而arg53则否。arg14和arg53在互补作用中的重要性差异可能与βgal m15突变体(δα1141)有关，前者位于缺失区而后者则否。因此，α片段的r53k突变体具有作为cedia供体片段的潜力，但其适用性尚需进一步去除trx标签蛋白并进行化学修饰与分析后才能确定。

【 参考 文献 】
　[1] henderson d r,friedman s b,harris j d,et al. cedia,a new homogenous immunoassay system[j]. clin chem,1986,32(9):1637-1641.

　　[2] yang x,janatova j,juenke j m,et al. an immunochip prototype for simultaneous detection of antiepileptic drugs using an enhanced onestep homogeneous immunoassay[j]. anal biochem,2007,365(2):222-229.

　　[3] jokerst n,royal m,palit s,et al. chip scale integrated microresonator sensing systems[j]. j biophotonics,2009,2(4):212-226.

　　[4] yager p,edwards t,fu e,et al. microfluidic diagnostic technologies for global public health[j].nature,2006,442(7101):412-418.

　　[5] tachi t,kaji n,tokeshi m,et al. microchipbased homogeneous immunoassay using a cloned enzyme donor[j]. anal sci,2009,25(2):149-151.

　　[6] franke t a,wixforth a. microfluidics for miniaturized laboratories on a chip[j]. chem phys chem,2008,9(15):2140-2156.

　　[7] welply j k,fowler a v,zabin i.βgalactosidase αcomplementation:effect of single amino acid substitutions[j]. j biol chem,1981,256(10):6811-6816.

　　[8] veronese f m. peptide and protein pegylation:a review of problems and solutions[j].biomaterials,2001,22(5):405-417.

　　[9] welply j k,fowler a v,zabin i. βgalactosidase αcomplementation overlapping sequences[j]. j biol chem,1981,256(13):6804-6810.