2016年诺贝尔生理或医学奖背景下的细胞死亡方式再认识

　　中图分类号 Q-49 文献标志码 E

　　2016年10月3日北京时间17：30，诺贝尔基金会宣布将2016年的诺贝尔生理学或医学奖授予大隅良典教授，以表彰他在自噬反应领域做出的卓越贡献。自噬反应属于Ⅱ型细胞凋亡类型。细胞死亡是生物界普遍存在的现象，不同于机体死亡。正常组织中，每天都有千千万万个细胞死亡，生物体主要通过严格控制细胞死亡和细胞增殖之间的平衡来调控细胞数量和质量。细胞死亡的方式通常有2种：细胞坏死、细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）。基于机制可以将程序性细胞死亡分为两大类：Caspase（半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶）依赖的和Caspase非依赖的，前者包括典型的细胞凋亡和新发现的细胞焦亡。下面重点介绍“细胞凋亡与细胞焦亡”这两种细胞死亡方式。

　　1 细胞凋亡

　　细胞凋亡一词最早是由英国的病理学家科尔和希腊语教授马克于1972年提出的。在希腊语中，apo的意思是脱离，ptosis的意思为落下，将这两个词组合（apoptosis）用来描述与秋叶落下和花儿凋谢类似的细胞死亡现象。到1990年，细胞凋亡的研究获得了里程碑式的重大进展，证明了细胞凋亡是基因调控的主动过程，典型的细胞凋亡过程涉及一系列Capase的水解、活化和信号传递过程。

　　1.1 细胞凋亡的形态学特征

　　细胞皱缩，?胞间的连接消失，同时细胞间的密度增加，核质浓缩成一个或几个大的包团，染色质迁移至核膜周边形成新月形凝集，细胞核裂解为碎块，进而细胞膜内陷自行分割成几个由细胞膜包裹的，表面光滑的凋亡小体；DNA被特异性的核酸内切酶分解成180～220 bp的片断，琼脂糖电泳出现特征性的DNA梯状区带，在细胞凋亡早期需要大量的ATP。

　　根据细胞的形态学变化，可将细胞凋亡分为3个阶段：

　　① 凋亡开始。细胞表面的微绒毛、细胞突起及细胞表面的褶皱等特化结构消失，但细胞膜依然完整，没有失去选择通透性；线粒体大体保持完整，但偶尔也见到线粒体变大，嵴增多；内质网囊腔膨胀扩大；细胞骨架的结构有时变得致密和紊乱；染色质浓缩，分布在核膜周围或一侧，呈眼球状。

　　② 凋亡小体的形成。凋亡小体的产生有两种方式。一种为发芽脱落方式：首先染色体断裂为大小不等的片断，然后通过发芽起泡，与一些细胞器聚集在一起，形成一球形的突起，形成凋亡小体。另一种为自噬体形成方式：凋亡细胞内线粒体、内质网等和一些细胞内的胞质成分一起被内质网膜包裹，再与细胞膜融合后，形成凋亡小体。

　　③ 凋亡小体的消化。凋亡小体形成后，被巨噬细胞或者邻近的细胞吞噬消化，此过程不影响细胞的其他生理功能，也不引起周围细胞的炎症反应。

　　1.2 细胞凋亡的过程

　　细胞凋亡的过程大致可分为以下几个阶段：接受凋亡信号→凋亡调控分子间的相互作用→蛋白水解酶的活化→进入连续反应过程。

　　细胞凋亡的启动是细胞在感受到相应的信号刺激后胞内一系列控制开关的开启或关闭。不同的外界因素启动凋亡的方式不同，所引起的信号转导也不相同，客观上说现在对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还是不全面的，其过程非常复杂，比较清楚的通路主要有：

　　（1） 细胞凋亡的膜受体通路：各种外界因素是细胞凋亡的启动剂，它们可以通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。以Fas-FasL为例：

　　Fas是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，与FasL结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡。它的活化包括一系列步骤：首先配体诱导受体三聚体化，然后在细胞膜上形成凋亡诱导复合物。这个复合物中包括带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD。Fas一旦和配体FasL结合，可通过Fas分子启动致死性信号转导，最终引起细胞一系列特征性变化，使细胞死亡。

　　Fas分子胞内段带有特殊的死亡结构域（death domain，DD）。三聚化的Fas和FasL结合后，使三个Fas分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD。FADD是死亡信号转录中的一个连接蛋白，由两部分组成：C端（DD结构域）和N端（DED）部分。DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，该蛋白再以DED连接另一个带有DED的后续成分，由此引起N段DED随即与无活性的Caspase-8酶原发生同嗜性交联，聚合多个Caspase-8的分子，Caspase-8分子遂由单链酶原转成有活性的双链蛋白，进而引起随后的级联反应，后者作为酶原而被激活，引起下面的级联反应，细胞发生凋亡。

　　（2） 细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学途径：线粒体不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡调控中心。实验表明了细胞色素C从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤。释放到细胞浆的细胞色素C在dATP存在的条件下能与凋亡相关因子1（Apaf-1）结合，使其形成多聚体，并促使Caspase-9与其结合形成凋亡小体，Caspase-9被激活，被激活的Caspase-9能激活其他的Caspase如Caspase-3等，从而诱导细胞凋亡。此外，线粒体还释放凋亡诱导因子如AIF，参与激活caspase。促凋亡因子能诱导细胞色素C释放和凋亡小体的形成。很显然，细胞色素C从线粒体释放的调节是细胞凋亡分子机理研究的关键问题。

　　尽管凋亡过程的详细机制尚不完全清楚，但是已经确定Caspase在凋亡过程中是起着必不可少的作用。细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。到目前为止，至少已有14种Caspase被发现，Caspase分子间的同源性很高，结构相似，都是半胱氨酸家族蛋白酶。根据功能可把Caspase基本分为二类：一类参与细胞的加工，如Pro-IL-1β和Pro-IL-1δ，形成有活性的IL-1β和IL-1δ；第二类参与细胞凋亡，包括Caspase2、3、6、7、8、9、10。 　　1.3 细胞自噬

　　细胞自噬又称Ⅱ型程序性细胞死亡，参与了多种疾病的发生和发展。自噬在古希腊语中是“自食”。它是一种保守的细胞自我降解方式，是将受损细胞器及大分子物质通过溶酶体降解再利用的过程。基础水平的自噬是维持细胞稳态所必需的，同时自噬参与抗衰老、分化及发育、免疫及清除微生物、肿瘤等疾病的病理生理过程。根据结合分子的方式，自噬分为巨自噬、微小自噬和伴侣分子介导的自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA）。

　　自噬是一系列自噬体结构演变的过程，由自噬相关基因（autophagy-related gene，ATG）执行精细的调控。在饥饿、低氧、药物等因素作用下，待降解的细胞成分周围会形成双层结构分隔膜，随后分隔膜逐渐延伸，最终将待降解的胞浆成分完全封闭形成自噬体；自噬体形成后将通过细胞骨架微管系统运输至溶酶体，二者融合形成自噬溶酶体；最终其内容物在溶酶体酶作用下被细胞降解利用。

　　自噬对细胞死亡的调节具有双重性：温和的自噬一定程度上保护细胞免受有害条件的侵害，促进细胞存活；严重或快速的自噬将诱导细胞程序性死亡，被称为自噬性细胞死亡（autophagy-mediated cell death，ACD）。

　　1.4 细胞凋亡的生理意义

　　细胞凋亡能确保个体正常发育、生长，根据代谢需要调节细胞数量、保持成体器官正常体积。如：指（趾）间隙的形成；细胞凋亡与胚胎发育、组织发生、组织分化和修复等过程有紧密的联系。为适应发育或组织更新的需要，机体中的细胞会在某些特定的时刻发生凋亡。如：在皮肤外层细胞的形成过程中，皮肤细胞生成于皮肤深层，然后慢慢向外表面迁移，迁移途中有些会发生凋亡，凋亡细胞就会形成具有保护作用的皮肤角质层。又如，人的唯一透明组织――眼球晶状体的发育，在胎儿形成早期阶段，由干细胞发育来的晶状体细胞与其他所有?胞一样都含有细胞器，但随着发育和分化的进展，晶状体细胞发生特殊形式的凋亡，胞质中的细胞核和细胞器被毁坏，只保留完整的细胞膜，细胞膜内包裹着极浓稠的“晶状体蛋白质”溶液，成为成熟的晶状体。

　　此外，在成年阶段，细胞凋亡也是机体清除体内多余的、受损的、癌变的或被微生物感染的细胞的重要手段。如T淋巴细胞在胸腺成熟过程中，约有95%以上不成熟的细胞发生凋亡，只有不到5%的细胞分化为成熟的T淋巴细胞进入外周血，并发挥其免疫学功能。

　　2 细胞焦亡

　　细胞焦亡是另一种程序性细胞死亡方式，2001年，华盛顿大学学者Cookson等首次使用“Pyroptosis”来形容在巨噬细胞中发现Caspase-1依赖的细胞死亡方式。其特征为依赖于caspase-1、caspase-4/5（人）、caspase-11（鼠）也可诱导细胞焦亡，还会出现大量促炎症因子的释放。细胞焦亡的形态学特征、发生及调控机制等均不同于凋亡、坏死等其他细胞死亡方式。细胞焦亡广泛参与感染性疾病、神经系统相关疾病和动脉粥样硬化性疾病等的发生发展。

　　2.1 细胞焦亡的形态学特征

　　研究表明，焦亡细胞在形态上同时具有凋亡和坏死的特征。与凋亡的形态学相似，焦亡细胞表现为细胞核浓缩，染色质DNA断裂以及TUNEL染色阳性。但与凋亡不同，细胞焦亡细胞膜完整性丧失后细胞内容物释放，诱发炎症反应。研究表明细胞发生焦亡时细胞膜有1～2 nm的小孔形成，正是这些小孔使细胞内的离子平衡丧失，水分内流，细胞肿胀继而膜破裂，细胞发生渗透性溶解。与细胞坏死的形态学也相似，表现为出现核碎裂、核溶解；细胞膜渗透性增高，细胞肿胀、破裂；胞质及内容物外泄，引起炎症反应。

　　2.2 细胞焦亡的分子机制

　　细胞焦亡的主要分子机制：细胞焦亡是依赖于Caspase-1的细胞死亡方式，Caspase-1由一个被称为炎症小体的复合物在感知病原信号后激活，经典的炎症小体包括NLRP1、NLRP3、NAIP-NLRC4、AIM2和Pyrin等，是多蛋白信号复合物，每个炎症小体包括1个Caspase激活和募集域（CARD）或PYD结构域。经典炎症小体在激活Caspase-1后，将无活性的IL-1β前体和IL-18前体裂解为有活性的IL-1β和IL-18，进一步诱导其它炎症细胞因子、趋化因子、粘附分子的合成，放大局部和全身炎症反应。老鼠和人的巨噬细胞和树突状细胞是Caspase-1依赖的细胞焦亡的主要细胞类型。另外，Caspase-11还能通过非经典炎症小体途径活化，导致细胞焦亡。脂多糖（LPS）能直接与Caspase11的CARD结合并激活，然后调控NLRP3炎症小体依赖的Caspase-1裂解，但目前这种细胞内脂多糖相关的作用机制还不清楚。同时，Caspase-4/5作为人类Caspase-11的相似物，能直接与脂多糖结合，激活与Caspase-11类似的细胞焦亡过程。

　　细胞程序性死亡（PCD）是个体生长发育及维持组织稳态的必要组成部分，细胞焦亡和细胞凋亡都属于细胞程序性死亡。细胞焦亡由inflammasomes激活的Caspase-1触发。Caspase-1激活可诱导IL-1β和IL-18分泌，细胞焦亡导致细胞溶解、胞质内容物释放到细胞外，引起炎症反应。作为一种伴随炎症反应的细胞死亡方式，细胞焦亡的意义并不亚于凋亡，在某些病理过程中，细胞焦亡甚至比凋亡更具实际意义。目前，较之于凋亡这一迄今为止研究最为深入的细胞死亡方式，随着对细胞焦亡的认识和研究刚刚起步，无论是在细胞焦亡的发生机制与调控机制，还是在细胞焦亡的检测技术方面都将需要更多更细致的研究。

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