医学微生物实验常用教学菌种保存方法的比较

　　菌种作为一项重要的生物资源，是医学微生物教学和研究的重要工作，同时与临床疑难菌株的鉴别分离有着密切联系。菌种保存方法因菌种而已，适宜的保存方法不仅可以保证细菌的存活，而且能保证细菌在形态、毒性及生化指标的稳定。本实验在比较各菌种保存方法优缺点的基础上，探索合适的菌种保存方法，选择简单易操作，对设备要求低的菌种保存方法以用于微生物的实验教学。

　　1材料与方法

　　1.1 材料

　　（1）供试菌种： 金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、伤寒沙门菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、乙型副溶血性链球菌、变形杆菌等。（2） 培养基： 普通营养琼脂、半固体、血琼脂培养基。（3）1.5ml EP管，2ml冻存管。（4）标签纸，封口胶布。（5）真空冷冻干燥机，-70℃ 冰箱。

　　1.2 保存方法

　　滤纸片保存法[1]：打孔器制取d=3mm圆形滤纸片，10ml普通试管加塞高压消毒灭菌备用，用灭菌镊子夹取滤纸片于平板上正反面蘸取待保存菌种的纯菌落1-2个。放于高压消毒灭菌后的1.5ml EP管再用封口胶带将盖边缘封好于-70℃冰箱保存。

　　甘油原液保存法：将纯化后的待保存菌种，用高压消毒灭菌后的滤纸片正反面蘸取1-2个菌落，置于1.5ml EP管中，滴加0.3ml甘油原液，胶带将盖边缘封好于-70℃冰箱保存。

　　菌种保存液法：配制：K2HPO4?：12.6g，柠檬酸钠0.98g，MgSO4?7H2O：0.18g，KH2PO4： 3.6g，甘油88g加蒸馏水至1000ml，121℃灭菌30分钟，4℃保存备用[2]。将细菌接种于普通琼脂平板或血平板，37℃培养24h后，加入3ml备用的菌种保存液，刮取菌落，洗下菌苔充分混匀。微量加样器取0.5ml菌液分装于2ml冻存管中，将盖拧紧于-70℃冰箱保存。

　　半固体保存法：将普通琼脂高压消毒灭菌后，无菌环境下取1ml分装2ml冻存管中，加盖备用。将待保存的菌种平板划线分离后，用接种针取单个菌落穿刺接种到备用的半固体培养基中，加盖拧紧在37℃ 下培养24h后，存放于-70℃冰箱保存。

　　脱脂牛奶冷冻干燥法[3]：鲜牛奶煮沸，冷却脱脂，8磅15min灭菌备用。取3ml脱脂牛奶加入待保存菌种平板内，用取菌环刮取菌落，轻轻磨匀。以微量加样器量取0.3ml脱脂牛奶菌悬液加入2ml冻存管，加盖拧紧4℃冰箱保存20min，再转到-20℃冰箱速冻30min.取出后，将盖稍拧松放于真空冷冻干燥机中，真空干燥24h。冷冻干燥结束后，将盖拧紧，于-70℃冰箱保存。

　　脱脂奶粉冷冻干燥法：配备15%奶粉乳液，煮沸冷却脱脂，8磅15min灭菌备用。取3ml脱脂奶粉乳液加入待保存菌种平板内，用取菌环刮取菌落，轻轻磨匀。以微量加样器量取0.3ml菌悬液加入2ml冻存管，加盖拧紧4℃冰箱保存20min， 再转到-20℃冰箱速冻30min。取出后，将盖稍拧松放于真空冷冻干燥机中，真空干燥24h。冷冻干燥结束后，将盖拧紧，于-70℃冰箱保存。

　　1.3 活力检测方法 分别于保藏后3、6、9、12个月进行复苏。从-70℃取出一套保存的菌种，37℃水浴快速解冻，根据菌种不同特性，选择不同培养基复苏，检测细菌的存活情况，计算存活率[4]。并结合教学实验进行细菌的形态、染色特性观察、生化反应指标检测和毒力的检测等，比较各教学菌种生物特性是否发生变化。

　　存活率=（菌株存活数/受检菌株数）×100%

　　2结果

　　6种方法保存1年后存活数量及存活率见表1。统计学分析，各组在存活率存在差异。脱脂牛奶冷冻干燥法和脱脂牛奶冷冻干燥法保存效果最好，复苏后全部存活，在细菌的形态、染色特性观察、生化反应指标检测和毒力的检测方面未发生改变。保存液法也能起到较好的保存作用，在短期保存效果上与以上两种方法相同。滤纸片法和甘油原液法在存活率及各项检测指标并无差异。半固体法一年内存活效果最差，复苏后细菌形态发生改变，部分生化指标异常。

　　3讨论

　　菌种保存是医学微生物教学必不可少的工作，菌种保存的目的不仅是保持菌种的活性，还要维持各菌种的典型生物学特性、形态，尽可能的不发生或少发生变异。

　　本实验表明滤纸片低温冷冻法保存菌种，操作方便、所需材料简单、菌种复苏便捷，保存时间长，也可避免因反复传代而造成的菌种生物学特性的改变，适用于一般医学微生物实验室保存营养要求条件不高的菌种。保存液低温冷冻保存法制作简单，不需要特殊设备，且不需要经常接种，可保存数年，但要注意保存的时候需直立存放。甘油原液低温冷冻法，细菌在低温高渗下代谢率低，甘油的保护缓冲作用有利于细菌的稳定性，不易发生变异，保持个菌种的生物学特性，而且操作简单，保存时间较长。半固体琼脂低温冷冻法，该方法简单易操作，技术要求不高，且复苏简单，但该方法适用于抵抗力较强、营养要求不高的菌种保存，保存时间较短，需反复传代接种保存，易造成菌种变异，适用实验室短期保存。真空冷冻干燥低温保存法保存时间长，生物学特性不易发生变性，牛奶和奶粉保存菌种无材料差异，但操作过程复杂、难度大，需要较长时间才能完成，所需的真空冷冻干燥机一般实验室难以配备，所以此方法适合于有条件的实验室对菌种的长期保存。

　　综上所述， 一般微生物实验室对教学菌种的保存，可采用保存液低温冷冻法，此方法操作简单，且无需专业设备，可保存数年，复苏方便。有条件的实验保存教学菌种，可采用真空冷冻干燥低温法，此方法要求较高的实验设备，操作过程虽繁琐，但保存时间可长达数十年，无需反复接种保存，菌种特性稳定且不易发生变异，该方法最适合医学微生物教学菌种的保存。

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