LNT对视神经损伤后RGC保护作用的实验研究

论文导读：随机分成5组，一组（6只12眼）为正常对照组，另4组（各12只12眼）为实验损伤组，其中左眼为损伤对照组（即视神经钳夹＋玻璃体腔内注射0.1ml生理盐水组），右眼为损伤治疗组（即视神经钳夹＋玻璃体腔内注射100ug/0.1ml香菇多糖组）。TUNEL检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，均购自南京建成生物研究所。
关键词：视神经损伤，香菇多糖，视网膜神经节细胞，超氧化物歧化酶

　　视神经由视网膜神经节细胞（RGC）的轴突组成，为中枢神经系统的一部分，损伤后由于缺乏神经修复和再生所需的微环境和物质，因此视神经损伤后的治疗和功能恢复是临床上的一个难题[1]。几十年来，视神经损伤的治疗多采用药物治疗和手术治疗两种方法。药物疗法多是采用神经营养因子、兴奋性氨基酸拮抗剂、神经节苷脂、钙通道阻滞剂、氧自由基清除剂、糖皮质类固醇等，对改善血管源性组织水肿，抑制过氧化脂质的形成，提高视神经损伤的组织修复能力，对恢复视神经功能起到一定的作用，但效果仍不理想，且多处于动物实验阶段。因此，寻找一种具有综合疗效且毒副作用小的神经保护剂是近两年众多学者研究的方向。许多人把目标转向了神经免疫疗法，并不断将免疫增强剂投入实验研究，已取得了一定成果。早在1998年我国就有将生物多糖注射入大鼠玻璃体内治疗视神经损伤的实验记载[2]。香菇多糖（LNT）是1969年被首次发现。LNT进入机体后能快速通过血脑屏障及血眼屏障发挥作用，是目前国内外都广泛应用的抗肿瘤药物。实验证实香菇多糖有清除氧自由基、调节一氧化氮(NO)及抗脂质过氧化、提高SOD活性的作用[3,4]。本研究旨在通过Tunel及生化法检测RGC的凋亡及SOD活性变化情况，探讨LNT影响RGC的的影响进行了初步研究。
　　1.1 实验动物及分组
　　纯种大耳白兔54只，体重3.0±0.2kg，雄性，外眼及眼底检查均正常。随机分成5组，一组（6只12眼）为正常对照组，另4组（各12只12眼）为实验损伤组，其中左眼为损伤对照组（即视神经钳夹＋玻璃体腔内注射0.1ml生理盐水组），右眼为损伤治疗组（即视神经钳夹＋玻璃体腔内注射100ug/0.1ml香菇多糖组）。各组分别于伤后1d、3d、7d和14d取材。
　　1.2 主要试剂及材料
　　香菇多糖，购自南京康海药业股份公司。论文参考网。TUNEL检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）测试盒，均购自南京建成生物研究所。论文参考网。
　　1.3 模型制备
　　正常对照组不做任何处理。实验组均用10%的水合氯醛（3mg/kg）耳缘静脉注射麻醉，于兔眼眶上皮肤切口逐层分离暴露视神经。游离视神经约3mm，离后极部约3mm处用同一大号无创血管钳于同一部位钳夹视神经15s。术后兔眼对光反射迟钝，眼球无明显突出，眼压正常，眼睑闭合完全者为成功模型。伤后充分散瞳，用无菌结核菌素皮试注射器抽取1mg／1ml的香菇多糖0.1ml（100ug）给实验损伤组兔右眼做玻璃体内注射，实验损伤组兔左眼同样方法注入0.1ml生理盐水，术后处理同右眼。
　　1.4 取材及固定
　　实验损伤组的兔各组随机抽取四只分别于致伤后1d，3d，7d和14d用以下方法取材固定：10%的水和氯醛耳缘静脉注射麻醉。切开胸腔暴露心脏，将生理盐水冲洗液用输液器针头穿刺入左心室至升主动脉，剪开右心耳放血，至右心耳流出清亮液体为止，换成PH值为7.2的4%多聚甲醛固定液，再灌注固定15－20分钟。摘除眼球并保留视神经长约5mm，做角膜穿通口,置于上述固定液中固定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片厚约2.5μm，备用。其它动物采取空气栓塞法处死后，取出眼球，至于冰生理盐水中，剪开角巩膜缘，弃去眼前节及玻璃体，外翻眼球壁，在显微镜下剥离视网膜，分析天平称重，用生理盐水稀释，匀浆，低温离心机3000r/min离心10分钟，取上清液，黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。
　　1.5 检测指标
　　光镜下观察视网膜形态及视网膜节细胞数量的变化；行Tunel染色观察凋亡细胞的定位并计数；行黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性。
　　1.6 统计方法
　　数据用SPSS13.0软件包,取为P=0.05检测标准采用单因素方差分析法进行统计分析。
　　2 结果
　　2.1RGC形态及数量改变
　　视网膜切片中显示凋亡细胞不仅见于视网膜神经节细胞层，还见于内外核层。凋亡细胞胞核染色呈棕黄色，部分可由于核固缩扭曲破裂而失去正常形态，并可见凋亡小体。正常对照组视网膜切片偶见极少量的凋亡细胞0.31／mm2。本实验仅计数节细胞层的凋亡情况进行比较研究。损伤对照组：于伤后1d、3d、7d和14d的凋亡细胞数分别为1.58／mm2、14.21／mm2、25. 61／mm2、12.09／mm2。损伤治疗组：于伤后各时间点的凋亡细胞数分别为1.10／mm2、9.95／mm2、18.33／mm2、10.20／mm2。除1d组外，同一时间点损伤对照组和损伤治疗组比较，差异具有统计学意义（P<0.05）。说明此种治疗方法能够减少视神经损伤后RGC的凋亡。
　　2.2视网膜内SOD活性：正常视网膜组织匀浆中SOD活性为214.68μU/mgprot。损伤对照组SOD活性：各时间点分别为154.68μU/mgprot、299.11μU/mgprot、238.56μU/mgprot、217.56μU/mgprot。损伤治疗组SOD活性：各时间点分别为254.87μU/mgprot、333.77μU/mgprot、291.07μU/mgprot、232.44μU/mgprot。除伤后14d组外，同一时间点损伤对照组和损伤治疗组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。表明香菇多糖能明显降低脂质过氧化物的产生，提高超氧化物歧化酶的活性，从而降低视网膜受氧自由基损伤的程度。
　　3 讨论
　　视神经夹伤后对轴突产生直接的机械压迫效应造成部分轴突损伤，通过应激反应刺激RGC发生急剧的生化反应而迅速溃变坏死。部分受损的RGC释放的细胞毒素、氧自由基，或局部的钙离子超载等作用，导致RGC发生以凋亡为主的继发性改变，使得RGC进一步丢失并丧失视功能。本实验观察到损伤实验组于伤后1d即出现凋亡细胞，伤后3d时凋亡细胞显著增多，伤后7d时凋亡细胞达高峰，14d凋亡率下降。文献报道[5]及本实验凋亡细胞计数结果表明，视神经损伤后凋亡程序一旦被启动，凋亡细胞的数量将逐渐增加，达到一个高峰，然后再逐渐减少直至停止凋亡，这种变化规律与治疗与否无关。但是视神经损伤后早期恰当的治疗能够使细胞凋亡程度减弱，凋亡细胞数量的峰值降低，使残存的节细胞数量增加，从而有利于保护伤后视功能。本实验损伤治疗组于伤后早期（1小时内）给予LNT玻璃体腔内注射，结果显示各时间点凋亡细胞数量较损伤对照组明显减少，较正常对照组又明显增多，也进一步验证了上述细胞凋亡的规律。论文参考网。因此，视神经损伤的治疗应在细胞凋亡程序启动之前进行，才能及时挽救濒死的视神经和保护未受损的神经。本实验通过早期单次玻璃体腔内给药能够减少视网膜节细胞的凋亡，为进一步的治疗争取到宝贵的时间。
　　　　近年来，LNT除了作为抗肿瘤药物在临床上被广泛应用，目前，在糖尿病等易造成机体组织缺氧的疾病研究中的疗效也日益凸现出来。侯敢等研究证实LNT具有清除氧自由基和调节NO及抗脂质过氧化的作用[6]。陈三妹等[7]实验探讨了LNT对糖尿病巨噬细胞脂质过氧化作用及一氧化氮(NO)水平的影响，结果发现LNT可使糖尿病大鼠巨噬细胞内的NO含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性升高，在防治糖尿病继发感染中有重要意义。此外，LNT对糖尿病大鼠的心肌亦有保护作用[8]。吴步猛等[9]实验还发现，使用了LNT的糖尿病大鼠，脑组织病变明显减轻，SOD活性明显升高，NO、MDA含量明显下降。因此说LNT还具有脑保护作用。LNT作为一种扶正祛邪中药具有明显的抗氧化剂保护神经细胞的作用。本实验证实玻璃体腔内注射LNT后，与损伤对照组相比较，治疗组视网膜的SOD活性明显升高而且治疗组凋亡的节细胞数显著低于损伤组，因此LNT能通过其抗氧化作用提高视网膜节细胞存活率，有效保护视功能。

参考文献
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2 Rapalino O, Lazarov-SpieglerO, Agranov C, et al. Implantation of stimulated homologous macrophages resultsin partial recovery of paraplegic rats[J]. Nat Med, 1998, 4:814-821.
3 郭丽花,姜德咏,邝国平,万华.巨噬细胞条件培养基对人视网膜色素上皮细胞活性和增值的影响[J].武警医学,2004,15(9):664-667.
4 Sicard RE. Differential inflammatory andimmunological responses in tissue regeneration and repair[M]. Ann NY. Acad Sci,2002,961:368-371.
5 朱豫,盛艳娟,黄波.大剂量甲基泼尼松龙对大鼠视神经挤压伤后RGC凋亡的影响[J]. ChinOphthal Res, 2003, 21: 582-585.
6 侯敢,黄迪南,祝其峰.香菇多糖多巨噬细胞一氧化氮和酶活性和还原性谷胱甘肽的影响[J].中国老年学杂志,2002,22(5):396-397.
7 陈三妹,李剑敏,陈国荣,等.香菇多糖对糖尿病大鼠巨噬细胞脂质过氧化和一氧化氮的影响[J].温州医学院学报,2003,33(5)325-326.
8 陈三妹,毛孙忠,陈国荣,等.香菇多糖对糖尿病大鼠的心肌损伤影响的实验研究[J].中国病理生理杂志,2003,19(8):1097-1099.
9 吴步猛,陈锡文,李旭升,等.香菇多糖对糖尿病大鼠脑组织损伤的影响[J].中国比较医学杂志,2005,15(3):136-138.
 

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