巴戟天醇提物对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤后

[摘要] 目的 探讨巴戟天醇提物对心肌缺血再灌注损伤（IRI）后白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及心肌细胞凋亡的影响。 方法 取健康雄性Wistar大鼠80只，随机分为空白对照组、IRI组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组四组，每组各20只。利用Langendorff灌流技术制备心肌IRI模型，两个巴戟天用药组分别在预灌时给予相应浓度的药物。灌流结束后，各组取10只大鼠左心室组织，采用ELISA法检测其IL-1β、TNF-α的表达；取另外10只大鼠左心室组织，采用TUNEL法检测其心肌细胞凋亡情况。 结果 与IRI组相比，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组IL-1β、TNF-α表达降低（P < 0.05），凋亡指数降低（P < 0.05）。 结论 巴戟天醇提物能够减轻心肌IRI后心肌细胞凋亡，这可能与其能够降低心肌组织中的IL-1β、TNF-α表达有关。
　　[关键词] 巴戟天醇提物；心肌；缺血再灌注损伤；白介素-1β；肿瘤坏死因子-α；细胞凋亡
　　[中图分类号] R96 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）10（b）-0011-03
　　心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）是指心肌较长时间缺血后恢复血供时心肌损伤反而加重的一种病理生理学现象，目前已经受到广大医学工作者的关注[1]。大量研究表明，炎症反应在心肌IRI的发生、发展过程中发挥着重要作用[2-3]。白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、黏附分子等炎症因子在心肌IRI的发生、发展过程中均通过各种途径发挥重要作用。巴戟天属于茜草科植物，肉质根可以入药，具有补肾壮阳之功效。以往的研究表明，巴戟天醇提物具有减轻心肌IRI的作用[4]，且这种作用可能与其能够减轻IRI心肌细胞脂质过氧化及细胞凋亡有关，但是关于IL-1β、TNF-α等炎症因子在巴戟天醇提物保护IRI心肌中的变化尚未见报道。因此，笔者利用Langendorff灌流装置制备离体大鼠心脏IRI模型，以期探讨巴戟天醇提物对大鼠心肌IRI后IL-1β、TNF-α表达以及心肌细胞凋亡的影响。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 药品与试剂 巴戟天购自广东省德庆县药材公司，一等品，由河南省食品药品检验所鉴定，由所购生药提取得到巴戟天醇提物；IL-1β、TNF-α酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测试剂盒购自美国R&D公司，批号分别为：110521、110430；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定[terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL]法检测试剂盒购自美国Roche公司，批号：13764213211；其他试剂均是国内分析纯。
　　1.1.2 仪器 Langendorff灌流装置（上海奥尔科特生物科技有限公司）；CASTEAX2100型全自动酶联免疫分析仪（美国Beckman公司）；Biofuge Stratos台式高速低温离心机（德国Heraeus公司）。
　　1.1.3 实验对象 健康雄性Wistar大鼠，体质量260～303 g，平均（281±18）g，购自河南省实验动物中心。
　　1.2 方法
　　1.2.1 离体心脏灌流模型的建立 用腹腔注射质量分数2%的戊巴比妥钠（0.2 μL/g）方法麻醉大鼠，同时注射质量分数2%的肝素钠（0.1 μL/g）抗凝；开胸出取心脏，放于盛有0～4 ℃预冷灌流液的器皿中，冲洗后，于Langendorff灌流装置上开始进行灌流。灌流压：82 kPa；以Krebs-Hanseleit磷酸缓冲液作为灌流液，其成分（mmol/L）如下：NaCl 118，NaHCO3 25.0，KCl 4.7，MgSO4·7H2O 1.2，KH2PO4 1.2，CaCl2 22.5，Glucose 11.0，pH为7.4；渗透压达到300 mOsm/L。灌流前用95% O2+5% CO2混合气体平衡15 min，灌流过程中保持，保持装置内温度处于37 ℃，并持续通气。
　　1.2.2 分组及处理方法 80只健康雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、IRI组、巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组四组，每组各20只。空白对照组：持续灌流110 min；IRI组：预灌20 min，保持在37 ℃条件下，停灌60 min，再复灌30 min；巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组：分别在预灌时加入浓度为600、300 mg/L巴戟天醇提物，其他处理同IRI组。
　　1.2.3 IL-1β、TNF-α的检测方法 离体大鼠心脏灌流结束后，每组中取10只剪取左心室，用滤纸吸干，然后用匀浆器将左心室组织制成质量分数0.85%生理盐水匀浆，4℃低温高速离心机3 500 r/min离心10 min，取适量上清液，采用ELISA法检测IL-1β、TNF-α的表达，具体操作按照试剂盒说明书进行。
　　1.2.4 心肌细胞凋亡的检测方法 离体大鼠心脏灌流结束后，每组中取另外10只大鼠剪取左心室，用40 g/L多聚甲醛固定，然后经梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋等，最后制成4 μm切片进行TUNEL染色。TUNEL法具体操作按照试剂盒说明书进行。TUNEL染色后，正常心肌细胞的细胞核呈蓝色，而发生凋亡的心肌细胞的细胞核呈棕黄色。每只大鼠心脏观察3张切片，每张切片在400倍镜下选择5个视野，每个视野计数100个细胞，然后计算心肌细胞的凋亡指数。凋亡指数=（总凋亡细胞数/总观察细胞数）×100%。
　　1.3 统计学方法
　　采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，IL-1β、TNF-α及凋亡指数计量资料用均数±标准差（x±s）表示，并进行正态性检验和方差齐性检验，比较采用单因素方差分析和LSD-t检验，检验水准α=0.05。
　　2 结果
　　2.1 心肌缺血再灌注后各组IL-1β、TNF-α水平比较
　　与空白对照组相比，IRI组的IL-1β、TNF-α水平升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与IRI组比较，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组IL-1β、TNF-α水平降低（P < 0.05）；巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组的IL-1β、TNF-α水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。
　　2.2 心肌缺血再灌注后各组心肌细胞凋亡指数比较
　　与空白对照组比较，IRI组的心肌细胞凋亡指数升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。与IRI组比较，巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组凋亡指数降低（P < 0.05）；巴戟天高剂量组和巴戟天低剂量组的凋亡指数比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表 2。
　　3 讨论
　　心肌IRI是一个多机制参与、多因素相互影响而导致的复杂的病理生理过程，发生过程中存在多条信号转导通路的相互作用。近年来，大量研究表明，炎症反应也参与了心肌IRI的形成[3，5-6]。冠状动脉再通后，中性粒细胞能够释放IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α、细胞间黏附分子（ICAM）等炎症因子，这些炎症因子相互影响、相互作用，形成一个动态的细胞因子网，能够促进血管内皮细胞的通透性增加、中性粒细胞的黏附、通过血管壁等活动，进而导致心肌的损伤或心肌细胞的凋亡等。总之，炎症反应通过炎症因子的分泌或释放对IRI后心肌产生各种不同的影响，从而促进或阻止心肌IRI的发生、发展。
　　IL-1β是一种重要的炎症因子，在正常心肌组织中的表达较低，当心肌IRI发生时其水平明显增加。IL-1β引起心肌组织损伤的机制可能是：IL-1β能够直接上调ICAM-1等的表达，进而诱导中性粒细胞黏附于内皮细胞及其基质并通过内皮进入缺血区，经释放氧自由基和栓塞微血管等途径，最终引起IRI后心肌的损伤及细胞的凋亡[7-8]。TNF-α也是一种重要的炎症因子，通常情况下，其在心肌组织中的水平较低，当心肌IRI发生后，损伤的细胞会大量释放TNF-α，而其通过以下途径促进心肌IRI的进展：TNF-α能够抑制心肌收缩功能；刺激内皮细胞和中性粒细胞产生黏附分子，加快加重细胞间的黏附以及血管内凝血，从而导致心肌细胞发生坏死、凋亡等，加重心肌IRI的程度。TNF-α同时还参与心肌细胞的损伤后重建[9-10]。
　　本研究结果显示：IRI组的心肌组织中IL-1β、TNF-α水平均高于空白对照组，进一步提示这两种炎症因子参与了心肌IRI的进程，也可作为心肌IRI程度的评估指标；巴戟天醇提物两个剂量组的IL-1β、TNF-α水平低于IRI组，提示巴戟天醇提物能够通过减轻心肌IRI后的炎症反应而减轻心肌损伤。本研究表明，心肌IRI后，心肌细胞凋亡指数增加，进一步提示心肌IRI的形成有心肌细胞凋亡的参与，也可作为心肌IRI程度的评估指标；巴戟天醇提物两个剂量组的心肌细胞凋亡指数低于IRI组，提示巴戟天醇提物降低了心肌IRI后心肌细胞凋亡。
　　综上所述，巴戟天醇提物能够减轻心肌IRI后心肌细胞凋亡，这可能与其能够降低心肌组织中的IL-1β、TNF-α表达有关，巴戟天醇提物可能通过这一途径发挥保护IRI心肌的作用。
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