浅谈风湿佳抗炎镇痛对免疫作用的探究

　　提要　通过对风湿佳抗炎、镇痛及免疫抑制作用的研究，为临床应用提供理论依据。方法：1.抗炎作用：小鼠耳廓肿胀法和大鼠足跖肿胀法。2.镇痛作用：小鼠扭体法和大鼠钾离子皮下透入致痛法。3.免疫抑制作用：测定小鼠脾淋巴细胞转化率;巨噬细胞的吞噬功能;外周血T淋巴细胞的百分率;迟发性的变态反应(DTH);血清溶血素和抗体形成细胞功能测定。

        结果：风湿佳有明显的抗炎作用，并能加强可待因的镇痛作用和免疫抑制作用，与生理盐水对照组比较有非常显著的差异(P<0.01)。

        结论：风湿佳有抗炎、镇痛及免疫抑制作用。

　　关键词　风湿佳;　大鼠;　小鼠;　抗炎;　镇痛;　免疫抑制

　　Analgesic,Anti-inflammatory and Immunosuppressive Effects of Fengshijia XU Qing-rong, GAO Yong, LI Na, WAN Qiao-yun, LI Jin-lian, SONG Min (Binzhou Medical College,Binzhou, Shandong, 256603 China)

　　Abstract　Objective:To study the analgesic,anti-inflammatory and immunosuppressive effects of s:The anti-inflammatory effect was determined with the models of the swelling of mouse ear and the rat carrageenin paw analgesic effect was determined with mouse writhing method and rat subcutaneous K+penetrate immunosuppressive effect was determined with ratio of lymphocyte blastogenesis,phagocytotic function of macrophage,percentage of peripheral T-lymphocyte,delayed type hypersensitivity and antibody forming cell s:Compared with NS control group, Fengshijia possessed the significant anti-inflammatory and immunosuppressive effects,and could also strengthen the analgesic effect of codeine(P<0.01).Conclusion:Fengshijia possesses analgesic,anti-inflammatory and immunosuppressive effects.

　　Key words　Fengshijia;　Rat;　Mouse;　Anti-inflammatory;　Analgesic;　Immunosuppressive

　　风湿佳是由川乌、草乌、红藤等中药组成，用38° 白酒提取而得。民间早已用于治疗风湿、类风湿等疾病，效果良好。为了得到基础理论的支持，我们作了大量的动物实验，对其抗炎、镇痛、免疫抑制作用及毒理作用进行了初步研究，为今后开发、推广应用提供理论依据。

　　1　材料

　　1.1　动物：大鼠由山东省卫生防疫站动物室提供。小鼠、豚鼠、绵羊由滨州医学院动物室提供。

　　1.2　药品：风湿佳由滨州医学院药理教研室制备(由38°白酒提取而得，生药含量0.5 g/ml);地塞米松、可待因均由山东省新华制药厂生产;38°白酒由山东省孙武酒厂提供。

　　1.3　仪器：痛阈测量仪(WQ-9 E型)北京海淀电子医疗仪器厂生产。二道生理记录仪(LMS-2 B型)成都仪器厂生产。

　　2　方法

　　2.1　抗炎作用

　　2.1.1　对抗新鲜鸡蛋清致大鼠足跖肿胀的作用[1，2，3]：取体重180～200 g Wistar大鼠50只(雌雄不拘)，随机分为5组，药前用自制的容积测定仪测定左侧足跖容积，然后分别用下列药物灌胃：50%风湿佳(0.5 ml风湿佳加0.5 ml凉开水)1 ml/100 g体重;25%风湿佳(0.5 ml风湿佳加0.5 ml凉开水)1 ml/100 g体重;50%的38°白酒(0.5 ml白酒加0.5 ml凉开水)1 ml/100 g体重;地塞米松50 mg/kg体重;等容量生理盐水。30 min后每组大鼠左侧足跖均皮下注射10%的新鲜鸡蛋清0.1 ml，药后30，60，90，120，150 min均以药前相同的方法测左侧足跖容积，以用药前后足跖容积差作为肿胀程度。

　　2.1.2　对抗二甲苯致小鼠耳廓肿胀作用[1，3]：取昆明种小鼠50只，体重(25±2) g，随机分为5组，然后分别用下列药物灌胃;50%风湿佳0.1 ml/10 g体重;25%风湿佳0.1 ml/10 g体重;50%的38°白酒0.1 ml/10 g体重;地塞米松25 ml/kg;等容量生理盐水。给药1 h后，左耳涂30 μg二甲苯致炎。3 h后颈椎脱臼处死，用直径9 mm打孔器在左右两耳相同的部位打下耳片，称重，以左右耳片差作为肿胀程度。

　　2.2　镇痛作用

　　2.2.1　加强可待因的镇痛作用(钾离子皮下透入致痛法)：取180～200 g Wistar大鼠50只(雌雄不拘)，随机分为5组。药前每只大鼠均用WQ-9 E型痛阈测量仪测大鼠的痛阈值3次(作尾部皮肤致痛刺激，根据甩尾报痛时电流的大小，表示痛阈值的高低)，取均数作为药前痛阈值，然后分别用下列药物灌胃;50%风湿佳1 ml/100 g体重加可待因;50%风湿佳1 ml/100 g体重;50%的38°白酒1 ml/100 g体重加可待因;可待因;等容量生理盐水。可待因均为10 mg/kg(阈下剂量)，药后30，60，90，120 min均以用药前相同的方法测得每只大鼠的痛阈，用药前后痛阈值之差作为痛阈提高程度。

　　2.2.2　加强可待因的镇痛作用(小鼠扭体法)[1，4]取昆明种小鼠50只，体重(20±2) g，随机分为5组，然后分别用下列药物灌胃：50%风湿佳0.1 ml/10 g体重加可待因;50%风湿佳0.1 ml/10 g体重;50%的38°白酒0.1 ml/10 g体重加可待因;可待因;等容量的生理盐水。可待因均为15 mg/kg(阈下剂量)。30 min后每只小白鼠腹腔注射醋酸0.9 mg，药后10 min内观察是否出现扭体反应。

　　2.3　免疫抑制作用[1，5，6]

　　2.3.1　对小白鼠脾淋巴细胞转化率的影响：取昆明种小白鼠80只，体重(20±2) g，随机分为5组，然后分别用下列药物灌胃：50%风湿佳0.1 ml/10 g体重;25%风湿佳0.1 ml/10 g体重;50%的38°白酒0.1 ml/10 g体重;地塞米松50 mg/kg体重;等容量的生理盐水。灌胃1次/d，连续灌胃14 d，第15 d颈椎脱臼处死，无菌条件下取脾脏，置于盛有适量hanks液的小平皿内，用小镊子轻轻撕碎制成单个脾细胞，经200目筛过滤，100 r/min离心10 min，用Hanks液洗2次，最后将细胞悬浮在3 ml RPMI 1640完全培养基中，调整细胞数在5×106个/ml。取上述脾细胞悬液3 ml加PHA 2 mg，37℃培养72 h，移入离心管，100 r/min离心10 min，弃去上清液，底层制成0.5～1 ml细胞悬液，滴片2张，染色镜检，计数100个脾细胞，观察转化为母细胞的数量计算百分率。

　　2.3.2　对小白鼠外周血T淋巴细胞百分率的影响：采用α-醋酸奈酶(ANAE)染色法，与上面脾淋巴细胞转化实验共用一批小白鼠，末次灌胃后，取小白鼠尾血涂片，干燥后置37℃卵育液中2 h，冲洗后2%甲基绿复染，干燥后油镜下检查100个淋巴细胞，记录阳性细胞(T淋巴细胞)数，求出T淋巴细胞百分率。

　　2.3.3　对小白鼠迟发性变态反应(DTH)的影响(小白鼠足跖增厚法)：取昆明种小白鼠60只，体重(20±2) g，分组及给药均同脾淋巴细胞转化实验，灌胃第10 d用绵羊红细胞(SRBC)腹腔注射0.2 ml/只，致敏小白鼠，免疫后第4 d，即末次灌胃后测量每只小白鼠左后足跖部厚度，然后每只小白鼠左后足跖皮下注射2% SRBC 20 μl，药后24、48 h，用药前相同的方法测左后足跖厚度3次，取均数，用药前后足跖厚度差表示DTH的程度。

　　2.3.4　对小白鼠巨噬细胞吞噬功能的影响：取小白鼠60只，分组与给药均同脾淋巴细胞转化实验。末次灌胃后腹腔注射1%鸡红细胞悬液1 ml/只。30 min后颈椎脱臼处死，用腹腔渗出液涂片，甲醇固定，吉姆萨染片，镜下观察100个巨噬细胞，求出吞噬率和吞噬指数。

　　2.3.5　对小白鼠血清溶血素的影响：与DTH实验共用一批小白鼠，即DTH测量结束后，摘眼球采血于离心管内，分离出血清备用，用生理盐水将血清倍比稀释，将不同血清分别置于血凝试验板上，每孔100 μl，再加入0.5% SRBC 100 μl混匀，保持温度37℃温育3 h，观察血球凝集程度。

　　2.3.6　对抗体生成细胞功能的影响：与DTH共用一批小白鼠，即DTH测量结束后，摘眼球采血后，无菌条件下取脾，制成脾细胞悬液(方法同前)，取正常5只豚鼠血清混合，按每5 ml血清中加入SRBC 1 ml震荡30 min，离心取上清液制成补体，冷冻保存备用，将表层培养基(1 g琼脂糖加双蒸水100 ml)，加热溶解，放在45℃水浴中保温，与等量pH值7.2两倍浓度hanks液混合，分装小食管，每管0.5 ml，再向管内加入10% SRBC 50 μl、脾细胞悬液20 μl，迅速混匀倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待凝固后将玻片扣放在片架上，37℃温育1～1.5 h，然后加入SA缓冲液稀释的补体(1∶10)继续温育1～1.5 h，计数溶血空斑数。

　　2.4　急性毒性实验：取小白鼠40只，体重(25±2) g，随机分为4组，用风湿佳分别以下列剂量灌胃：6 ml/kg，10 mlg/kg，16 mlg/kg和27 ml/kg，后2剂量分2～3次在1 d内灌完。灌胃后很快出现酒醉状态，2～3 h后部分动物开始恢复，观察10 d，各组动物死亡数分别为0，2，8，10只。

　　2.5　统计方法：计量资料数据用±s表示，组间比较用t检验，计数资料用X2检验。

　　3　结果

　　3.1　抗炎作用

　　3.1.1　对抗新鲜鸡蛋清致大白鼠足跖肿胀的作用：实验结果表明，高浓度风湿佳药后30 min足跖肿胀程度与生理盐水对照组比较有显著性差异(P<0.05)，药后60，90，120，150 min足跖肿胀程度与生理盐水对照组比较有非常显著性差异(P<0.01)，高浓度风湿佳与地塞米松组比较无显著性差异(P<0.05)。结果见表1。

　　表1　风湿佳对抗新鲜鸡蛋清致大白鼠足跖肿胀的作用(n=10，±s)

　　组别 剂量

　　C/g。kg-1 药后不同时间足跖肿胀程度υ/ml

　　30 min 60 min

　　风湿佳 5 0.10±0.08* 0.01±0.13**

　　风湿佳 2.5 0.20±0.09 0.15±0.09

　　白酒 5 0.20±0.05 0.15±0.07

　　地塞米松 0.05 0.08±0.02* 0.05±0.01**

　　生理盐水 10 0.27±0.07 0.26±0.08

　　组别 药后不同时间足跖肿胀程度υ/ml

　　90 min 120 min 150 min

　　风湿佳 0.02±0.12** 0.02±0.14** 0.03±0.09**

　　风湿佳 0.18±0.09 0.19±0.12 0.12±0.08

　　白酒 0.16±0.07 0.16±0.18 0.16±0.05

　　地塞米松 0.03±0.10** 0.01±0.14** 0.01±0.15**

　　生理盐水 0.20±0.05 0.21±0.04 0.20±0.06

　　注：与生理盐水组比较*P<0.05，**P<0.01

　　3.1.2　对抗二甲苯致小白鼠耳廓肿胀的作用：实验表明，高浓度风湿佳药后小白鼠耳廓肿胀程度与生理盐水对照组比较有非常显著性的差异 (P<0.01)，低浓度风湿佳药后耳廓肿胀程度与生理盐水对照组比较有显著性差异(P<0.05)，高浓度风湿佳与地塞米松组相比较无显著性差异 (P>0.05)。结果见表2。

　　表2　风湿佳对抗二甲苯致小白鼠耳廓肿胀的作用(n=10，±s)

　　组别 剂量C/g。kg-1 左右耳片重量之差m/mg

　　风湿佳 5 0.05±0.37**

　　风湿佳 2.5 0.10±0.32*

　　白酒 5 0.48±0.84

　　地塞米松 0.025 -0.10±0.33**

　　生理盐水 10 0.8±0.74

　　*P<0.05　　**P<0.01

　　3.2　镇痛作用

　　3.2.1　加强可待因的镇痛作用(大白鼠钾离子皮下透入致痛法)：实验表明，风湿佳加可待因组痛阈提高程度与生理盐水对照组比较有非常显著性差异 (P<0.01)，风湿佳组与生理盐水对照组比较有明显差异(P<0.05)，可待因组与生理盐水对照组比较无显著性差异(P>0.05)，证明可待因是阈下剂量。结果见表3。

　　3.2.2　加强可待因的镇痛作用(扭体法)：实验表明，风湿佳加可待因组扭体反应动物数与生理盐水对照组比较有非常显著性的差异(P<0.01)，结果见表4。

　　表3　风湿佳加强可待因的镇痛作用(钾离子皮下透入致痛法)

　　(n=10，±s)

　　组别 剂量

　　C/g。kg-1 药后不同时间痛阈提高程度I/mA

　　30 min

　　风湿佳加可待因 5 0.3±0.18**

　　风湿佳 5 0.12±0.24*

　　白酒加可待因 5 0.05±0.18

　　可待因 0.01 0.22±0.17

　　生理盐水 10 0.03±0.05

　　续表3

　　组别 药后不同时间痛阈提高程度I/mA

　　60 min 90 min 120 min

　　风湿佳加可待因 　0.35±0.08** 　0.37±0.24** 　0.35±0.13**

　　风湿佳 　0.20±0.08* 　0.23±0.29* 　0.24±0.22*

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