创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织转位蛋白的表达及抗

　脓毒症脑病（septic encephalopathy，SE）是由脓毒症导致的急性、弥散性、可逆性脑损伤，是脓毒症最常见的并发症之一，近年来日益受到关注［1-2］。临床观察显示SE可显著增加脓毒症患者病死率，并影响ICU出院患者认知功能的恢复及生活质量，其发病机制尚不清楚［3］。目前认为，炎症损伤、缺血缺氧、线粒体功能障碍、细胞凋亡等机制在SE发病中占据重要地位［4］。转位蛋白18 kDa（translocator protein 18 kDa，TSPO）广泛分布于脑神经胶质细胞的线粒体外膜上，正常情况下表达水平低。当各种病因致使神经组织损伤和炎症反应时，随着神经胶质细胞聚集活化，TSPO的表达可迅速增高，参与局部炎症的调节与损伤的修复，是反映中枢神经系统损伤及神经胶质细胞活性的敏感指标［5］。SE发病时中枢神经系统TSPO的表达及变化至今尚不清楚。笔者推测TSPO可能参与SE的致病过程，TSPO水平可能是反映SE中枢神经系统的损伤的敏感指标。因此本研究构建创伤弧菌大鼠脓毒症模型，观察其脑组织中TSPO、促/抗炎症因子的表达及病理变化，并观察敏感抗菌药物干预的影响，现报道如下。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验动物 实验动物采用清洁级Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄各半，共100只，体质量为180～260 g，由温州医学院实验动物中心提供。
　　1.2 细菌来源 从创伤弧菌感染患者下肢血疱中抽取疱液，接种在血平板上，37 ℃、24 h培养分离纯化，细菌鉴定为创伤弧菌（细菌编号：705258），按常规方法制作成创伤弧菌悬液，含菌量为6×108cfu/ml备用。
　　1.3 实验试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司，逆转录试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR试剂盒购自Fermentas公司。RIPA裂解液（强），BCA浓度测定试剂盒，彩色预染蛋白质分子量标准，辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）、辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG（H+L），ECL试剂和显影定影试剂盒，均购自碧云天生物技术研究所；兔抗人PBR抗体购自Santa Cruz公司 和小鼠抗大鼠的β-actin抗体购自Abcam公司。免疫组化试剂盒由温州长风生物有限公司提供，头孢哌酮钠和左氧氟沙星注射液［分别由第一三供制药（北京）有限公司和中诺药业（石家庄）有限公司提供，批号分别为：0907E74、090403027］。TNF-α，IL-10，IL-6 ELISA试剂盒购自武汉博士德公司。
　　1.4 实验方法
　　1.4.1构建大鼠创伤弧菌脓毒症脑损伤模型及实验分组 SD大鼠100只，雌雄各半，饲养1周，实验前禁食12 h，自由进水。随机（随机数字法）分组为4组，每组10只。A组（健康对照组，n=10），麻醉后处死。B组（创伤弧菌脓毒症组，n=40），予左后肢皮下注射创伤弧菌悬液，细菌含量为6×108 cfu/ml，剂量为0.1 ml/100 g，制作大鼠创伤弧菌脓毒症模型［6］；分别在染菌后6、12、24和48 h点麻醉后处死，各时相大鼠10只。C组（抗菌药物干预组，n=40），感染创伤弧菌同B组，在染菌后4 h，给予左侧腹腔注射头孢哌酮钠180 mg/kg（12 h/次），左氧氟沙星18 mg/kg（12 h/次）；分别在染菌后6、12、24和 48 h时间点麻醉后处死，各时相大鼠10只。D组（抗菌药物对照组，n=10），予正常大鼠左侧腹腔注射头孢哌酮钠180 mg/kg（12 h/次）和左氧氟沙星18 mg/kg（12 h/次），48 h麻醉处死。快速腹主动脉采血，常规方法制备血清， -70 ℃冰箱保存待用。麻醉后取鼠脑，无菌留取脑组织，部分新鲜组织分别浸泡在4%多聚甲醛溶液、2.5%戊二醛磷酸缓冲液中待做免疫组化及电镜，余下组织用4 ℃生理盐水冲洗后迅速置于液氮中保存待用。
　　1.4.2 RT-PCR法检测大鼠脑组织TSPO表达 取冻存大鼠脑组织80～100 mg，Trizol试剂提取总RNA，以总RNA为模板，按RT试剂盒说明书逆转录成cDNA，然后以cDNA为模板，建立PCR反应体系，PCR反应程序为：变性94 ℃，30 s，退火67 ℃ ，30 s，延伸72 ℃，60 s，首次循环94 ℃预变性5 min，然后进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min。引物序列及PCR条件见表1。扩增产物用1.6%琼脂糖凝胶电泳，同时和适量DNA ladder，电泳结果用凝胶成像系统成像，Gelpro32分析软件进行分析，以目的基因/RGOF为基因表达的相对值进行比较。
　　1.4.3 Western blotting检测大鼠脑组织TSPO蛋白含量 取脑组织约60 mg，按照RIPA裂解液说明书提取蛋白，采用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度，上样前加5×上样缓冲液，煮沸5 min，上样量10 μg。配制10%的分离胶和5%的浓缩胶（聚丙烯酰胺凝胶），电泳时浓缩胶80 V，20 min，分离胶120 V，60 min；冰水浴中转膜320 mA，35 min，5%脱脂牛奶（光明乳业股份有限公司）室温下封闭90 min，兔抗TSPO抗体（1∶1000）和小鼠抗β-actin抗体（1∶10 000）4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体（1∶500）和辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠抗体（1∶1000）室温下孵育2 h，洗膜后ECL试剂盒显色，曝光成像，Quantity One分析软件进行分析，以目的蛋白/β-actin为蛋白表达相对值进行比较。
　1.4.4 免疫组化法检测并观察大鼠脑组织TSPO的表达 石蜡组织切片常规脱蜡，梯度水化，3%H2O2室温封闭，抗原修复，5%BSA封闭，一抗孵育4 ℃过夜，二抗孵育，滴加SABC，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，光镜下观察。
　　1.4.5 ELISA法检测大鼠脑组织TNF-α、IL-6、IL-10蛋白的表达 取待测大鼠脑组织100 mg，按脑湿质量与生理盐水比例为100 mg∶1 ml，玻璃匀浆器匀浆，取匀浆液，4 ℃，3000 r/min，离心15 min取上清，按照TNF-α，IL-6，IL-10 ELISA试剂盒中步骤严格操作，结果测定采用芬兰Thermo公司生产的酶标仪（型号：DENLEY DREGON Wellscan MK3）以Ascent software for Multiskan软件进行分析。
　　1.4.6 透射电镜下观察脑组织超微结构 电镜下观察A组脑组织超微结构，以A组为参照，观察B组24 h、C组24 h、D组脑组织的超微结构。
　　1.5 统计学方法 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS 13.0进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 大鼠脑组织TSPO的表达及抗菌药物的影响
　　A、D两组比较，TSPO基因、蛋白表达差异无统计学意义。与A组比较，B组各时间点大鼠脑组织TSPO mRNA及蛋白表达 均明显升高（P<0.05），24 h达峰。与D组比较，C组6、12、24 h大鼠脑组织TSPO mRNA及蛋白表达明显升高（P<0.05）。与B组相应时间点比较， C组12、24、48 h时点大鼠脑组织TSPO mRNA及蛋白表达明显降低（P<0.05）。见表2，图1和图2。
　　2.2 免疫组化法检测结果 采用免疫组化法检测观察创伤弧菌大鼠脑组织TSPO的表达及抗菌药物的影响。光镜下观察TSPO免疫组化结果，A组和D组大鼠脑组织无明显差别（图3A、 D），B组24 h可见团状脑组织液化，棕灰色颗粒较多（图3B），C组24 h大鼠脑组织可见少量点状液化灶，棕灰色颗粒较B组24 h明显减少（图3C）。
　　2.3 大鼠脑组织TNF-α、IL-6、IL-10蛋白变化
　　A、D两组比较，TNF-α、IL-6、IL-10蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与A组比较，B组大鼠脑组织各时间点TNF-α、IL-6、IL-10水平均明显升高（P<0.05），其中TNF-α在6 h即达峰值，随后逐渐回落，而IL-6水平12 h达峰值， IL-10水平在48 h达峰值。C组TNF-α、IL-6、IL-10水平明显高于对照组，其变化趋势基本与B组相同。与B组相同时间点比较，6、12、24 h时点 C组大鼠脑组织TNF-α水平明显降低，12、24、48 h时点脑组织IL-6水平亦明显下调，而脑组织IL-10水平在各时间点均较B组明显升高（P<0.05）。见表3。
　　2.4透射电镜下观察脑组织超微结构
　　透射电镜下大鼠脑组织超微结构，健康对照组（A组）大鼠脑组织神经元细胞核形态正常，较大，偏位，常染色体多，胞浆内有分泌颗粒和游离核糖体及粗面内质网及溶酶体（图4A）。D组较A组差别不大（图4D）。B组24 h大鼠脑组织神经元细胞核溶解消失，核内及胞浆间质水肿明显，游离核糖体显著减少，线粒体消失，粗面内质网明显扩张，整个细胞密度稀疏（图4B）；C组24 h大鼠脑组织神经元细胞核变形，部分溶解，但形态尚存，细胞水肿较B组减轻，胞浆内细胞器的损伤程度较B组明显减轻，整个细胞密度较B组密集（图4C）。
　　3 讨论
　　创伤弧菌脓毒症在沿海地区散发，起病急，进展迅速，常并发肝、肾、脑等多脏器功能不全，病死率高达50%～70%［7］，早期应用敏感抗菌药物联合外科切开减张能改善患者预后［8-9］。本研究以创伤弧菌注射大鼠后肢构建创伤弧菌脓毒症模型，脑组织炎症反应明显增高，同时电镜观察到大鼠脑神经细胞肿胀，密度稀疏十分明显，神经元细胞核溶解，线粒体消失，粗面内质网扩张等，与SE患者尸检所见的脑实质损伤相近［10］，提示本研究中脓毒症脑损伤模型构建成功。
　　神经胶质细胞作为中枢神经系统重要的执行免疫监视和宿主防御功能细胞，其活化被认为是中枢神经系统微环境变化最敏感的标志［11］。TSPO，原名为外周型苯二氮卓受体（PBRS），在中枢集中分布于神经胶质细胞的线粒体外膜上，参与调节胶质细胞的增殖、分化、免疫、吞噬及凋亡等［12-13］。最近研究发现TSPO在静息的胶质细胞中表达很低，而在胶质细胞激活后呈现明显高表达［14］，提示TSPO的表达是反映各种病理状态下胶质细胞活化程度的生物学指标，这为TSPO作为反映脓毒症脑损伤的敏感指标提供了理论可能。
　　SE发病是脓毒症全身炎症反应在中枢神经系统局部的表现，过度炎症反应、血管内皮损伤、缺血缺氧等病理生理反应必将导致脑内微环境的改变，导致神经胶质细胞迅速激活，并释放多种细胞因子及毒素，介导并加重脑组织的损害，同时伴随着TSPO的过度表达。本研究也证实，创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织早期即可出现TSPO的高表达，并随着病情进展持续增高，与脑组织炎症反应及病理损伤程度具有很好的一致性。而且TSPO表达在脓毒症6 h即可明显升高，早于脑组织明显的病理改变。可见，脓毒症脑损伤致病中，神经胶质细胞的活化发挥了重要作用，而TPSO表达是反映脓毒症脑损伤的敏感指标。有研究利用TSPO配体PK 11195（PBR的拮抗剂）拮抗TSPO效应，能降低小鼠体内促炎因子的表达，减轻脑损伤，显示了良好的抗炎作用［15-16］。提示TPSO不仅是反映脓毒症损伤的生物学指标，而且可能参与脓毒症损伤的致病过程，通过拮抗或下调TPSO的表达可能是治疗脓毒症脑损伤的潜在靶点。
研究结果表明，抗菌药物干预能明显下调TSPO的表达，其原因可能与抗菌药物能有效抑制细菌倍增，从源头减轻炎症反应，减少神经胶质细胞的活化与脑损伤有关，提示敏感抗菌药物能有效地干预创伤弧菌脓毒症脑损伤。
　　本研究中采用头孢哌酮钠和左氧氟沙星干预能明显增加大鼠脑组织IL-10的水平，有效抑制炎症反应。其机制尚不明确。推测可能与抗菌药物参与调控机体免疫功能有关［17-19］。Purswani等［20］研究表明，给予环丙沙星预处理能明显降低脓毒症小鼠体内的TNF-α和IL-12水平，提高IL-10水平，从而改善小鼠存活率。Ci等［21］研究发现，预先给予头孢噻呋也具有类似的作用，能明显降低脓毒症小鼠体内TNF-α、IL-1β 、 IL-6水平，增高IL-10水平。由此可见，头孢类药物及氟喹诺酮类抗菌药物不仅可以直接杀灭细菌，而且能调节机体的免疫［22］。但目前尚无直接证据支持头孢哌酮钠和左氧氟沙星也具有免疫调节的作用，故有待进一步研究。
　　综上所述，本研究结果证实创伤弧菌脓毒症大鼠脑组织TSPO表达在早期即明显升高，是反映脑损伤的敏感指标。不仅如此，TSPO极可能也参与调节脓毒症脑损伤的病理生理过程。应用敏感抗生素干预后能有效下调TSPO表达，减轻脓毒症脑损伤。
　　参考文献
　　［1］ Wratten ML. Therapeutic approaches to reduce systemic inflamma-tion in septic-associated neurologic complications［J］. Eur J Anaesthesiol Suppl， 2008，42：1-7.
　　［2］曾红科，江稳强.提高脓毒症脑病的早期识别与诊治［J］.中华急诊医学杂志，2010，19（12）： 1241-1243.
　　［3］ Sprung CL， Peduzzi PN， Shatney CH， et al. Impact of encephalopathy on mortality in the sepsis syndrome. The Veterans Administration Systemic Sepsis Cooperative Study Group［J］. Crit Care Med， 1990 ，18（8）：801-806.
　　［4］ 费翔，张庆红，姚咏明.脓毒性脑病免疫障碍机制研究进展［J］.中华烧伤杂志，2011，27（2）：128-130.
　　［5］ Chen MK， Guilarte TR. Translocator protein 18 kDa （TSPO）： molecular sensor of brain injury and repair［J］. Pharmacol Ther，2008，118（1）：1-17.
　　［6］ 卢中秋，邱俏檬，周铁丽，等.肝病大鼠创伤弧菌脓毒症血清基质金属蛋白酶-9的动态变化［J］.中华急诊医学杂志，2008，17（3）：1456-1458.
　　［7］ 卢中秋，卢才教，洪广亮，等.34例创伤弧菌脓毒症患者的流行病学特点及临床诊治［J］.中华急诊医学杂志，2009，18（7）：732-736.
　　［8］ 梁欢，卢中秋，邱俏檬，等.创伤弧菌脓毒症大鼠肝组织因子和组织因子途径抑制物的基因表达及抗生素的影响［J］.中华急诊医学杂志，2010，19（7）：726-730.
　　［9］ Hong GL， Lu CJ， Lu ZQ，et al. Surgical treatment of 19 cases with vibrio necrotizing fasciitis［J］. Burns，2012，38（2）： 290-295.
　　［10］ Sharshar T， Annane D， de la Grandmaison GL， et al. The neuropathology of septic shock［J］. Brain Pathol， 2004，14（1）：21-33.
　　［11］ Zhang Z， Chopp M， Powers C. Temporal profile of microglial response following transient （2 h） middle cerebral artery occlusion［J］. Brain Res，1997，744（2）：189-198.
　　［12］ Casellas P， Galiegue S， Basile AS. Peripheral benzodiazepine receptors and mitochondrial function［J］. Neurochem Int， 2002，40（6）：475-486.
　　［13］Papadopoulos V， Lecanu L. Translocator protein （18 kDa） TSPO： an emerging therapeutic target in neurotrauma［J］. Exp Neurol， 2009，219（1）：53-57.
　　［14］ Scarf AM， Kassiou M. The translocator protein［J］. J Nucl Med， 2011，52（5）：677-680.
　　［15］ Torres SR， Frode TS， Nardi GM， et al. Anti-inflammatory effects of peripheral benzodiazepine receptor ligands in two mouse models of inflammation［J］. Eur J Pharmacol， 2000，408（2）：199-211.
作者单位：325000 浙江省温州，温州医学院附属第一医院急诊科（洪广亮、向兰、卢中秋、赵光举、吴斌、李萌芳），普外科（戴晓琴），伤骨科（张纯武）