塞来昔布对鼻咽癌CNE2细胞增殖抑制的实验

【摘要】 目的研究环氧化酶2抑制剂塞来昔布对鼻咽癌细胞cne2增殖的影响。方法采用mtt法测定细胞代谢率，以流式细胞术观察细胞dna含量和凋亡的变化情况，免疫组化sp法检测cox2的表达情况。结果塞来昔布对cne2细胞有明显的增殖抑制作用，呈时间和剂量依赖性。细胞周期各时相dna 含量改变明显，g0～g1期细胞显著升高 (由最初47.03%升至最高79.20%)，而s、g2～m期细胞明显下降；凋亡率显著增高。塞来昔布明显下调细胞中cox2蛋白的表达。结论塞来昔布对鼻咽癌cne2 细胞有明显的增殖抑制作用，并且呈时间和剂量依赖性，使细胞聚集在g0/g1期,其机制涉及cox2依赖性途径。

【关键词】 塞来昔布；cox2；细胞增殖；鼻咽癌

growth inhibition of nasopharyngeal carcinoma cell line cne2 by celecoxib

yi fang1，2, xu xinhua1，2,fu xiangyang1，2,dai delan1，2,li daojun1，2,zhang changju3

ment of oncology,central hospital of yichang city,the first clinical medical college of three gorges university,yichang 443003,china;gy research institute of three gorges university,l collegeabstract：objective to investigate the growth of nasopharyngeal carcinoma cell line cne2 treated with a selective cyclooxygenase2 inhibitor, sthe cell survival rate was measured by mtt assay, the cell cycle and apoptosis were analyzed using flow cytometric method (fcm), the expression of cox2 protein in cne cells treated with celecoxib was detected by sp scelecoxib remarkably inhibited the growth and proliferation of cne2 tumor cells, which was demonstrated in a time and dose dependent effect. the dna content in each phase of cell cycle has significantly changed as follows; cell numbers in g0~g1 fraction increased significantly (from 47.03% up to the highest percentage of 79.20%), whereas it decreased in s and g2m phase of cell cycle. apparently apoptosis was induced in cne2 cells by celecoxib. from the result of immunochemistry sp method it suggested that celecoxib dramatically suppressed the expression of cox2 in cne2 sioncelecoxib effectively inhibited the growth and proliferation of cne2 tumor cells which induces accumulation of tumor cells in g0/g1 phase. importantly, the mechanism of antitumor effect by celecoxib may include cox2 dependent ways.

key words：celecoxib; cox2; cell proliferation; nasopharyngeal carcinoma

1材料与方法

1.1主要试剂塞来昔布购于安徽合肥森瑞化工有限公司，rpmi1640 培养基为美国gibco公司产品，小牛血清为杭州四季青产品，噻唑蓝(mtt)为美国sigma公司进口分装，碘化丙啶(pi)购于sigma公司，鼠抗人cox2单克隆抗体为美国santa cruz产品，sp超敏试剂盒和dab显色试剂盒均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.2细胞培养人鼻咽癌细胞株cne2 从中南大学湘雅医学院肿瘤研究所引进，培养在rpmi1640＋10%小牛血清＋双抗(青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml)、37℃、5 %co2中，每隔1～2d传代一次。

1.3mtt 法检测塞来昔布对cne2细胞增殖活性的影响塞来昔布用95%的乙醇溶解，配成40mmol/l 的储存液备用。取指数生长期细胞用0.25%胰酶消化，稀释成1×105/ml，每孔200μl 接种于96 孔板并与下列浓度的药物共同培育：50、100、150μmol/l，对照组为含1ml/l乙醇的培养液。分别培养24h、48h和72h。培养结束后，每孔加mtt 20μl，继续培养4h，弃上清，加二甲基亚砜150μl，震荡10min使mtt结晶完全溶解，酶联免疫检测分析仪测定492nm 处吸光值(a492 )，计算不同浓度下的抑制率。抑制率＝[ (对照组a492-实验组a492)/对照组a492]×100%。

1.4流式细胞术检测细胞周期和凋亡根据mtt结果计算得出24h的ic50值约为80μmol/l。取对数生长期的细胞制成1×105/ml的细胞悬液接种于50ml培养瓶，培养24h后与下列浓度的塞来昔布80μmol/l、100μmol/l共同培育(24h)，收集细胞，离心洗涤，用70%的冷乙醇固定，4℃过夜。测试前用pbs 溶液洗2遍，核糖核酸酶(rnase) 100μg/ml水浴30min。再加碘化丙啶(pi)50μg/ml，室温避光孵育20min，300目的尼龙膜过滤后上流式细胞仪分析。

1.5sp法检测cox2蛋白的表达情况取对数生长期的细胞制成1×105/ml的细胞悬液，接种于预先置有洁净无菌盖玻片的6孔培养板中，待细胞贴壁后加入塞来昔布80μmol/l共同培育，同时设阴性对照组；24h后弃上清，用pbs洗3遍，再用冰丙酮固定15min，自然干燥后采用sp法检测，参照使用说明书进行。cox2阳性为细胞浆染成棕褐色。

1.6统计学方法采用spss10.0 统计分析软件。mtt采用单因素方差分析，细胞周期结果和cox2蛋白表达采用t检验。均以p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1mtt法检测塞来昔布对cne2细胞增殖的影响塞来昔布对cne2细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着给药剂量的增大，抑制作用增强，并且随着作用时间的延长，抑制作用增强，见图1。图1cne2细胞与不同浓度塞来昔布培育后的生长抑制率

2.2塞来昔布对cne2细胞增殖周期各时相及凋亡的影响80μmol/l 的塞来昔布处理24h对细胞有增殖抑制作用，g0/g1期细胞比例增加，s期细胞减少，100μmol/l 处理后，细胞在g0/g1期聚集进一步增加，s期细胞继续减少，并有g2/m期细胞数减少，见表1。表1塞来昔布对cne2 细胞周期及凋亡的影响

　　2.3塞来昔布对cne2细胞中cox2蛋白表达的影响正常cne2细胞经免疫组化染色后，细胞浆染成棕褐色，见图2a。经80μmol/l的塞来昔布处理24h后，cne2细胞浆棕褐色较对照组变浅，即cne2细胞中cox2表达下调，见图2b。

3讨论

　　选择性cox2 抑制剂塞来昔布的抗肿瘤作用引起了广泛的关注，已有报道塞来昔布剂量依赖性抑制结肠癌、胃癌、食管癌等多种实体动物肿瘤的生长[3]，对肝癌、乳腺癌等离体培养的癌细胞也有生长抑制作用[45]，有关塞来昔布应用于鼻咽癌细胞系的报道比较少。本研究通过观察塞来昔布对鼻咽癌细胞cne2增殖的影响，探讨其可能的作用机制，揭示其对鼻咽癌的防治作用。本实验结果显示，塞来昔布对cne2细胞的增殖具有明显的抑制作用，随着作用时间的延长和给药剂量的增大，抑制作用增强。mtt实验所得出的24h ic50值略高于相关报道[67]，其可能原因有实验条件的差异导致细胞生长速度不一致，细胞接种量的选择有差异。肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性生长，而失控性增生的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏[8]。流式细胞术行细胞周期分析显示：塞来昔布影响细胞各周期的正常比例，使g0/g1期比例增加，s期和g2/m期相应下降，提示塞来昔布通过抑制cne2细胞dna 合成，将细胞周期阻滞于g0/g1期，从而降低肿瘤细胞的增殖能力，产生抗肿瘤作用。cox2抑制剂抗癌途径包括cox2依赖性和非依赖性两种途径。chan等[6]采用western blot检测cne2细胞中没有cox2蛋白的表达或是蛋白的表达量太少无法检测，但我们的免疫细胞化学显示cne2细胞胞浆cox2蛋白表达强阳性，至于产生这种差异的原因目前还不清楚，有待于下一步研究证实。sp免疫细胞化学显示塞来昔布处理后cox2蛋白表达量显著降低，塞来昔布显著降低cne2细胞中cox2蛋白的表达，提示其抗肿瘤作用可能涉及cox2依赖性途径。塞来昔布抑制鼻咽癌cne2 细胞生长可能是通过抑制cox2 蛋白表达，从而抑制其产物 pge2的合成。本研究结果为塞来昔布抗鼻咽癌作用的机制提供了初步的实验依据。由于克服了传统nsaids 的一些副作用，包括塞来昔布在内的选择性cox2 抑制剂更有可能为鼻咽癌的防治开辟新的途径。

【参考文献】
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