浅谈低分子量透明质酸增强HAV抗原诱导的小鼠体

【摘要】 　　目的: 研究内源性危险信号分子低分子量透明质酸作为天然佐剂对hav抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响。方法: 将icr小鼠分成9组, 分别设生理盐水对照组、 hav抗原组、 hav抗原+铝佐剂组、 hav抗原+低分子量透明质酸50 μg组、 hav抗原+低分子量透明质酸100 μg、 hav抗原+低分子量透明质酸200 μg、 hav抗原+低分子量透明质酸300 μg、 hav抗原+低分子量透明质酸500 μg、 hav抗原+低分子量透明质酸1 mg组, 皮下免疫小鼠。分别在4、 8、 12 、 16周用elisa法检测小鼠血清抗hav igg水平。结果: （1）空白对照组在4、 8、 12 和16周未见抗hav igg产生; 各实验组抗hav igg水平在8周时达到最高; 12周和16周时各免疫组的抗hav igg水平逐渐下降, 尤以铝佐剂组下降明显; （2）与hav抗原组相比, 低分子量透明质酸各免疫组小鼠血清抗hav igg水平明显升高（p<0.05）; 与铝佐剂组相比, 低分子量透明质酸免疫组明显增强特异性抗hav igg水平（p<0.05或p>0.05）; （3）低分子量透明质酸安全无毒, 无过敏反应。结论: 低分子量透明质酸能够明显增强灭活hav抗原的体液免疫应答, 具有强的免疫佐剂作用。其免疫佐剂效应优于铝佐剂。

【关键词】 透明质酸 危险信号 佐剂

　　免疫佐剂对辅助抗原诱导机体产生持久高水平的免疫应答十分重要[1], 透明质酸（hyalouronan acid, ha）是从动物组织提取的一种黏多糖, 由（1β4）d葡糖醛酸和（1 β3）n乙酰基d氨基葡糖双糖单位重复连接组成。透明质酸是细胞外基质的重要成分而广泛分布于细胞外基质, 它是构成皮肤、 玻璃体、 关节滑液和软骨组织的重要成分, 具有独特的理化性质和生物学功能。近年研究表明, 低分子量透明质酸是免疫系统的一种重要内源性危险信号, 与tlr2作用后, 以依赖于myd88、 il1r相关激酶、 tnfr相关因子6、 蛋白激酶cζ、 nfκb的方式进行信号传导, 激活机体的天然免疫应答[2]。因此我们推测低分子量透明质酸可能具有免疫佐剂的特性。本研究中以低分子量透明质酸作为疫苗佐剂, 与hav抗原混合后皮下免疫接种小鼠, 观察内源性危险信号分子低分子量透明质酸对hav抗原诱导小鼠体液免疫应答的影响, 以探讨低分子量透明质酸作为疫苗佐剂的可行性。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料 icr健康小鼠(spf级, 雌性, 6～8周龄, 质量18～20 g), 由中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所灵长类实验动物中心提供, 并按实验动物中心的方法饲养。酶标仪（biorad microplate reader model 550）购自美国biorad公司。抗hav igg elisa检测试剂盒购自kpl公司, 酶标板购自美国ebioscienc公司。灭活hav抗原和al(oh)3佐剂均由本室保存。低分子量透明质酸（相对分子量（mr）为10000以下）购自江苏镇江东元生物科技有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 低分子量透明质酸的制备 用电子天平称取适量低分子量透明质酸, 用蒸馏水溶解配制成浓度为5 μg/l。

　　1.2.2 免疫动物 将icr雌性小鼠随机分成9组, 分别设生理盐水空白对照组、 hav抗原200 μg免疫组（hav）、 hav抗原200 μg+300 μg铝佐剂免疫组（haval）、 hav抗原200 μg+50 μg透明质酸免疫组（havha1）、 hav抗原200 μg +100 μg透明质酸免疫组（havha2）、 hav抗原200 μg +200μg透明质酸免疫组（havha3）、 hav抗原200μg +300μg透明质酸免疫组（havha4）、 hav抗原200 μg +500 μg透明质酸免疫组（havha5）和hav抗原200 μg +1 mg透明质酸免疫组（havha6）, 每组6只。免疫途径为皮下免疫, 共免疫1次。

　　1.2.3 血清抗hav igg水平检测 分别于免疫后4、 8、 12和16周对小鼠尾静脉采血, 血样37℃放置1 h后, 4℃过夜, 分离血清, 用elisa试剂盒检测抗hav的特异性igg水平, 具体操作方法按照试剂盒说明书。

　　1.2.4 低分子量透明质酸安全性检测 （1）低分子量透明质酸的异常毒性试验: 实验组选用icr小鼠10只, 雌雄各1半, 每只小鼠皮下注射5 mg低分子量透明质酸, 同时设立生理盐水对照组, 连续观察7 d。（2）低分子量透明质酸的刺激性试验: 取icr小鼠2只, 分别在一侧后肢股四头肌注射低分子量透明质酸（5 μg/l） 1 ml, 另一侧注射等量生理盐水。另取icr小鼠2只, 分别在一侧后肢脚掌注射低分子量透明质酸（5 μg/l） 1 ml, 另一只注射等量生理盐水。48 h后处死, 解剖观察局部组织变化。（3）低分子量透明质酸的过敏试验: 取icr小鼠10只, 雌雄各1半, 皮下注射50 μg低分子量透明质酸, 2周后再尾静脉注射50 μg低分子量透明质酸, 立即观察有无过敏反应。

　1.2.5 统计学分析 采用spss11.5统计软件进行单因素方差分析, 并进行levene方差齐性检验, 如方差齐, 则进行单因素方差分析; 而方差不齐则采用kruskalwallis h test, p<0.05具有统计学意义。

　2 结果

　　2.1 低分子量透明质酸安全性 （1）低分子量透明质酸的异常毒性试验: 试验期内所有动物均未出现松毛、 缩团、 发抖等异常反应; 进食、 饮水、 粪便和精神等均正常。实验结束后所有动物均健在且质量增加, 说明低分子量透明质酸安全无毒。（2）低分子量透明质酸的刺激性试验: 在小鼠股四头肌注射低分子量透明质酸48 h后解剖观察局部组织无充血、 水肿及硬结等异常变化; 小鼠后掌注射48 h后解剖观察局部也无异常变化。表明低分子量透明质酸剂量为5 mg时安全无毒性。（3）低分子量透明质酸的过敏反应: 小鼠在过敏试验中未出现蜷缩、 竖毛、 流泪、 喷嚏、 搔鼻、 抽搐、 痉挛、 呼吸困难、 水肿及休克等过敏反应。

　　2.2 不同剂量低分子量透明质酸免疫增强效应 初免后4、 8、 12、 16周检测抗hav igg水平, 结果显示生理盐水空白对照组检测不到抗hav igg, 各实验组小鼠在4周内均产生抗hav igg; 随着时间推移呈上升趋势, 到第8周达到抗体滴度的峰值, 此后逐渐下降; 但是不同剂量透明质酸免疫组的抗体水平仍然明显高于hav单独抗原免疫组以及铝佐剂组。不同剂量低分子量透明质酸免疫组在同一时间的抗体水平不同, havha4、 havha5和havha6组在8周时产生的抗hav igg的水平较高, 分别为1∶(359.19±2.25)、 1∶(320±3.46)、 和1∶(285.09±3.10); 且havha5和havha6组的抗体水平能够长时间维持在较高水平, 至16周时两组的抗hav igg水平分别为1∶(160±1.55)和1∶(113.13±2.25), 而其他实验组抗hav igg水平均已明显下降。提示低分子量透明质酸的免疫增强效应在一定范围内可能与免疫剂量成量效依赖性。

　　各低分子量透明质酸免疫组的免疫效应与hav抗原单独免疫组的免疫效应相比较, 结果显示, 4周、 8周、 12周和16周时结果显示不同剂量低分子量透明质酸免疫组的抗hav igg水平均明显高于hav抗原单独免疫组, 在4周时havh6免疫组的抗hav igg水平最高, 为1∶(201.59±3.10), 约为hav抗原单独免疫组的7倍, 二者相比有统计学意义（p<0.05）。8周时havha1组、 havha4组、 havha5组、 havha6组与hav抗原单独免疫组相比有统计学意义（p<0.05, 图1）。至12周和16周时, 所有剂量的低分子量透明质酸免疫组的抗hav igg水平与hav抗原单独免疫组相比有统计学意义（p<0.05, 图1）。这些结果表明, 低分子量透明质酸能够增强hav抗原的特异性体液免疫应答, 具有免疫佐剂效应。

　　各低分子量透明质酸免疫组的免疫效应与铝佐剂组的免疫效应相比较, 结果显示, 除havh3免疫组的抗hav igg水平在4周时低于铝佐剂免疫组以外, 其他各低分子量透明质酸免疫组的抗hav igg水平在4、 8、 12和16周时均要明显高于铝佐剂组。虽然在4周和8周时各低分子量透明质酸免疫组的抗体水平明显高于铝佐剂免疫组, 但是无统计学意义。在12周时结果显示, havha1组、 havha4组、 havha5组和havha6组与铝佐剂组的抗hav igg水平相比, 具有统计学意义（p<0.05, 图1）; 而havha2免疫组、 havha3免疫组的抗hav igg水平与铝佐剂组相比无统计学意义。至16周时, havha2组、 havha3组和havha5组与铝佐剂组的抗hav igg水平相比, 具有统计学意义（p<0.05）; 而其余低分子量透明质酸免疫组的抗hav igg水平与铝佐剂组相比无统计学意义。这表明低分子量透明质酸不仅具有免疫佐剂作用, 增强特异性的抗hav igg水平, 而且其佐剂效应在一定剂量范围内和一定时间内优于铝佐剂。

　　图1 不同时间小鼠血清抗hav igg水平（略）

　　ap<0.05与hav组; cp<0.05与haval组.

　　3 讨论

　　目前铝佐剂是惟一批准应用于人的疫苗佐剂, 但是铝佐剂存在诱导体液免疫应答, 而细胞免疫很弱, 与ige型过敏性疾病有关等弊端等[3]。理想疫苗佐剂应该是既能增强体液免疫应答, 又能诱导细胞免疫应答, 且无毒副作用[1]。因此, 研究开发新型疫苗佐剂, 以替代铝佐剂成为疫苗佐剂的研究热点。研究发现, 细胞损伤释放的内源性危险信号分子具有刺激树突状细胞成熟, 增加共刺激分子如cd86和cd83等的表达, 促进细胞因子的分泌; 介导t细胞免疫应答的作用[4, 5]。提示内源性危险信号分子可能作为有效的内源性免疫佐剂, 增强t淋巴细胞对外来抗原的免疫应答。

　　为了探讨内源性危险信号分子低分子量透明质酸作为疫苗佐剂的可行性, 本研究中采用灭活hav抗原和低分子量透明质酸进行不同剂量配比, 通过免疫小鼠观察了抗hav igg水平的变化, 并对低分子量透明质酸作为佐剂与铝佐剂的效应比较进行了初步探讨。研究证实, 低分子量透明质酸联合灭活hav抗原进行免疫, 有效地诱导了抗hav igg的产生。与单独灭活hav抗原组相比, 不同剂量低分子量透明质酸免疫组其产生的特异性抗体水平均明显高于hav抗原单独免疫组, 其差异性有统计学意义（p<0.05）, 提示低分子量透明质酸具有免疫佐剂效应; 与铝佐剂组相比, 不同剂量的低分子量透明质酸免疫组其诱导产生的免疫增强效应在不同时期显示优于铝佐剂或与铝佐剂相当; 且本研究结果还提示在一定范围内随着低分子量透明质酸的剂量的增加, 抗hav igg的水平逐渐增高, 即其抗hav igg水平与低分子量透明质酸在一定范围内可能呈量效依赖性。低分子量透明质酸是细胞外基质成分, 属于内源性危险信号分子, 具有无毒安全性高、 结构明确、 易于生产和价格便宜等特点, 符合理想疫苗佐剂的特点。本实验结果也证实了低分子量透明质酸安全无毒。

　　综上所述, 本实验以低分子量透明质酸作为新型疫苗佐剂,能够有效地增强灭活hav抗原的体液免疫应答, 而且不同剂量低分子量透明质酸免疫增强效应显示相当于或优于铝佐剂, 且低分子量透明质酸的免疫增强作用持续时间要长于铝佐剂。因此, 通过本研究提示, 低分子量透明质酸可以作为一种潜在的新型人用疫苗佐剂。同时, 随着许多重大疾病如hbv、 hiv、 肿瘤等严重危害着人类的健康, 开发新型治疗性疫苗迫在眉睫, 而寻找一种佐剂能够协同疫苗抗原诱导产生ctl免疫效应, 达到治疗疾病的作用是一种非常有潜力的策略。因此, 我们下一步的工作将进一步研究低分子量透明质酸是否能够诱导强的ctl免疫反应。

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