风湿关节炎片中士的宁含量测定方法的创新策略

　风湿关节炎片是由制马钱子、麻黄、当归、续断、桃仁、红花等17味药材制成的中药制剂，具有祛风燥湿、活血止痛的功效，用于治疗风湿痹痛、腰腿疼痛、风湿性关节炎等症。制马钱子为方中君药，在风湿类疾病中被广泛使用，但其本身具有较强的毒性，服用剂量不当极易出现中毒反应。风湿关节炎片收载于《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂》（第三册），原标准无含量测定方
　　法[1]。笔者参考文献[2-5]对该产品中制马钱子所含有效成分士的宁含量测定方法进行改进，在文献研究基础上建立了HPLC法测定风湿关节炎片中士的宁含量新方法，现总结报告如下。
　　1 实验材料
　　1.1 仪 器 SHIMADZU LC-10AT 高效液相色谱仪，梅特勒-托利多电子分析天平。
　　1.2 试 剂 士的宁对照品（批号110705-200306，
　　中国药品生物制品检定所提供），乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其余试剂均为分析纯。
　　1.3 药 品 风湿关节炎片（郑州福瑞堂制药有限公司生产，国药准字Z20121356，批号：130101，130301，130401）。
　　2 方法与结果
　　2.1 色谱条件 Hypersil C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×200 mm）；流动相为乙腈∶水∶三乙胺[（20∶80∶0.5），用冰醋酸调pH至2.9±0.2]；流速1.0 mL·min-1，检测波长为254 nm。
　　2.2 对照品溶液的制备 精密称取士的宁对照品适量，加甲醇制成每毫升含40 ?g的溶液，摇匀。
　　2.3 供试品溶液的制备 取供试品，除去薄膜衣，研细末；取细粉0.5 g，精密称定；加氨水2 mL充分润湿，精密加三氯甲烷25 mL，称定重量，超声处理1 h（期间每隔10 min振摇1次，每次1 min）；
　　取出放冷，加三氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过；取续滤液10 mL，水浴挥干；用甲醇溶解并稀释至10 mL，滤过，即得。
　　2.4 阴性对照溶液的制备 依处方比例，按制法制备缺制马钱子的阴性对照样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。
　　2.5 系统性试验 按2.1项下色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图。理论板数按士的宁峰计算，应不低于2 000，分离度 > 1.5，阴性无干扰，见图1、图2和图3。
　　2.6 方法学考察
　　2.6.1 线性关系的考察 精密取士的宁对照品溶液，制成药品浓度分别为10.1，20.2，40.4，60.6，
　　80.8 μg·mL-1的溶液，分别注入高效液相色谱仪，进样量10 μL，记录士的宁峰面积，以峰面积积分值Y为纵坐标，士的宁的浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为：Y = 32.298 34 X + 1.362 87 e-1，相关系数r = 0.999 99；表明士的宁在10.1～80.8 μg·mL-1之间呈良好的线性关系。
　　2.6.2 精密度试验 取同一士的宁对照品溶液10 μL
　　注入高效液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积，RSD为0.48%。
　　2.6.3 重复性试验 按正文含量测定方法，取重量差异项下同一批号（批号130101）样品，分别制备6份供试品溶液，分别进样测定士的宁峰面积，计算士的宁含量平均值为每片0.572 4 mg，
　　RSD为1.14%。
　　2.6.4 稳定性试验 取同一供试品溶液（批号130101），分别在0，2，4，6，8 h进样10 μL，测定士的宁峰面积，RSD为1.08%，表明供试品溶液在8 h内稳定。
　　2.6.5 加样回收率试验 取同一批号已知含量供试品（批号130101，士的宁含量每片0.572 4 mg）20片，精密称质量，求得平均片质量。研细，取
　　约0.25 g，精密称定，共取6份，分别加入士的宁对照品0.20 ，0.25，0.30 mg，供试品溶液按照制备方法制备，进样量10 μL，测定并计算平均回收率100.2%，RSD为0.68%。
　　2.7 供试品含量测定与限度确定 按照上述方法，取3批成品分别进行含量测定，结果批号130101士的宁含量为每片0.572 mg，批号130301士的宁含量为每片0.598 mg，批号130401士的宁含量为每
　　片0.625 mg。根据3批产品测定结果，拟定为本品每片士的宁（C21H22N2O2）含量应为0.55～0.65 mg。
　　3 讨 论
　　风湿关节炎片在文献中多采用氨水润湿后加三氯甲烷放置过夜，然后进行超声或回流提取的方法制备供试品溶液。经反复操作，发现该步骤对含量测定的重现性和准确性影响很大，考虑该产品为全粉末制剂，其制粒粘合剂为亲水性，先用氨水进行充分润湿后再以三氯甲烷提取
　　更为合理。笔者实际操作发现不放置过夜时即使长时间超声处理也难以将士的宁成分提取完全，而辅以振摇操作，则能很好解决该问题。经上述改进，使含量测定操作时间大为缩短，操作更加简便。
　　流动相的选择多选用甲醇-水-醋酸-三乙胺系统或乙腈-水-醋酸-三乙胺系统，本文优选后者并发现流动相pH值对士的宁峰的分离度有较大影响，经试验确定以冰醋酸将流动相调pH至2.9±0.2，该条件下目标峰可得到满意的分离度。
　　风湿关节炎片的有效性与日服用的制马钱子量有直接关系。本文通过改进后的方法可将批量生产的成品中士的宁的含量控制在每片0.55～0.65 mg，
　　极大地提高了日服用量的精确性，保证了本产品按用法用量服用的有效性和疗效稳定，同时又能直观防范其毒副反应的发生。
　　4 参考文献
　　[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准·中药成方制剂（第三册）[M].北京：中华人民共和国药典委员会，1990：23-49.
　　[2] 李晓妮，胡爽，葛新，等.HPLC法测定风湿关节炎片中士的宁和马钱子碱的含量[J].中草药，2003，34（10）：914-916.
　　[3] 蔡州，李海松，张滢.HPLC法测定风湿关节炎片中士的宁的含量[J].中医研究，2006，19（5）：24-26.
　　[4] 刘会东，李春英，叶敏，等.风湿关节炎片质量标准研究[J].药物分析杂志，2008，28（2）：291-293.
　　[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2010：47.