双荧光素酶报告基因验证微小RNA410对白细胞介素-13基因的靶向调

The Affiliated Hospital of Qingdao University;

Abstract：

Objective: To verify the targeted regulation role of microRNA410( miR-410) on expression of interleukin-13( IL-13 mRNA. Methods: The binding sites of miR-410 in 3'untranslated region( 3'UTR) of IL-13 mRNA were predicted by the bioinformatics software. IL-13 gene fragments binding miR-410 and mutant sequences were designed and synthesized. The wild and mutant luciferase reporter gene carriers were respectively constructed. miR-410 mimics or negative control of mimics were respectively co-transfected into293 T cells with wild or mutant luciferase reporter gene. The luciferase activity was detected to observe the effects of miR-410 on expression of IL-13 mRNA. Results: Bioinformatics analysis showed that there was binding site located in 3'UTR of IL-13 mRNA. The electrophoresis showed that the wild and mutant luciferase reporter gene carriers were constructed successfully. Through the dualluciferase reportier system,it was found that miR-410 could bind the wild-type IL-13 mRNA luciferase gene sequence and inhibit its expression,but had no effect on the mutant IL-13 mRNA luciferase expression( P<0. 05). Conclusion: IL-13 mRNA can be targeted by miR-410.

 

Keyword：

microRNA410; interleukin-13; dual-luciferase reporter system;

 

微小RNA(miRNA)是真核生物中一类长度为18～25个核苷酸的内源性非编码RNA，具有高度保守性、时序性和组织特异性，主要通过与靶基因mRNA的3’UTR上的互补区域结合，在转录后水平负性调控靶基因的表达，参与生物的发育、增殖、分化、凋亡过程[1-3]。哮喘是一种遗传易感性的慢性气道炎症性疾病，涉及多种细胞、细胞因子以及与免疫调节密切相关的信号通路[4]。越来越多的研究证据表明，多种miRNA参与哮喘的气道炎症调节[5]。本课题组前期研究发现，鸡卵白蛋白(OVA)诱导的哮喘小鼠体内微小RNA410(miR-410)含量较对照组明显降低，考虑miR-410可能参与哮喘发病过程。本研究拟通过生物信息学方法预测miR-410与IL-13基因的结合位点，并通过双荧光素酶报告系统验证miR-410对IL-13基因的直接靶向关系，为进一步探索miR-410在哮喘发病机制中的作用提供参考。

 

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

双荧光素酶检测系统、psi CHECK-2(promega);多功能酶标仪(Spectra Max i3x,Molecular Devices);凝胶成像系统(Tanon-1200，上海天能科技有限公司);大肠埃希菌菌株DH5α、293T细胞、miR-410模拟物和miRNA无义序列阴性对照、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司];IL-13目的基因序列和突变序列(Invitrogen);限制性内切酶Xho I和Not I、T4 DNA连接酶、DNA ladder (Fermentas);质粒DNA抽提试剂盒(Qiagen);KOD高保真酶PCR试剂盒、Taq酶(TOYOBA)。

 

1.2 方法

1.2.1 生物学信息预测

利用靶基因预测软件targetscan对miR-410靶向结合IL-13 3’UTR的位点进行分析，结合位点见图1。

 

1.2.2 双荧光素酶报告载体的构建和鉴定

分别化学合成IL-13 mRNA结合位点的野生型和突变型序列的正义链和反义链，目的片断插入Xho I、Not I位点。用Xho I、Not I 37℃酶切psi CHECK-2载体回收线性化载体片段。目的基因片段与线性化载体连接，将连接产物转化感受态细胞，筛选质粒克隆，提取质粒DNA，分别进行酶切鉴定及测序鉴定。

 

1.2.3 细胞转染

事先准备好用于转染的分到96孔板中的293T细胞和目的质粒。将10μL DMEM与0.16μL的psi CHECK-IL-13-wt/mut目的质粒以及miR-410-3p/Negative Control(NC)充分混匀后室温放置(溶液A)，之后将10μL DMEM与0.3μL的转染试剂充分混匀(溶液B)，室温放置5 min。将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20 min。转染前为细胞换取新鲜培养基，之后将转染混合物加入混匀。37℃、5%CO2培养。转染6 h后换取新鲜培养基，转染48 h后收集细胞检测。

 

1.2.4 荧光素酶报告基因验证

以96孔板每孔100μL的量加入细胞悬液，室温摇床上缓慢摇15 min后，将细胞裂解液吸至1.5 m L离心管，4℃12 000 r/min离心10 min，取上清液移入新的管子;96孔板中加入Luciferase Assay ReagentⅡ(LARⅡ)工作液100μL，加入20μL细胞裂解液，移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Firefly luciferase (Fl)值(内参值)。加入100μL Stop&Glo Reagent，移液枪吹打混匀2～3次，测定记录Renilla luciferase(Rl)值，即为报告基因发光值。

 

1.3 统计学方法

应用SPSS 22.0软件，计量资料以±s表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

 

2 结果

2.1 荧光素酶报告基因载体酶切分析

psi CHECK-IL-13-wt/mut质粒提取后应用Xho I、Not I双酶切，结果psi CHECK-IL-13-wt/mut在相应片段大小的位置切出来载体条带和目的DNA片段，释放出约500 bp大小的片段。见图2。

 

2.2 荧光素酶报告基因测序分析

将含有miR-410结合位点的野生型和突变型序列的IL-13 mRNA载体进行测序，结果表明野生型和突变型IL-13 mRNA荧光素酶报告载体均构建成功。见图3。

 

图2 psi CHECK-IL-13-wt/mut质粒的酶切鉴定

图3 psi CHECK-IL-13-wt/mut质粒酶切产物测序

2.3 荧光素酶活性测定

将miR-410模拟物与野生型载体psi CHECK-IL-13-wt共转染293T细胞后，细胞荧光素酶活性明显下降，与突变型载体psi CHECK-IL-13-mut比较差异有统计学意义(t=5.697,P<0.01);与对照组NC结合野生型psi CHECK-IL-13-wt载体比较，荧光素酶活性降低(t=2.852,P<0.05)。见图4。

 

图4 荧光素酶活性测定

3 讨论

支气管哮喘(简称哮喘)是由包括嗜酸粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、平滑肌细胞、气道上皮细胞等多种细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病[6]。近年来miRNAs在哮喘发生发展中的作用引起众多关注。miRNA是一种由18～25个核苷酸组成的非编码RNA，其功能强大，能够通过与靶基因mRNA的非编码区的结合位点结合并参与基因转录后的调控和基因的降解[7]。越来越多的研究发现miRNA在哮喘发病机制中具有重要作用[8-10]。Williams A E等[11]发现，哮喘患者肺组织中miR-92、miR-26a、miR-200c、miR-16、let-7b、miR-125、let-7及miR-26的含量与正常对照组存在差异。Kumar M等[12]研究证实，let-7在缓解哮喘气道炎症、降低气道高反应性、防止黏膜上皮细胞化生及上皮细胞纤维化方面的作用。本课题组前期研究显示，miR-410在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型中的表达水平明显低于对照组小鼠，提示miR-410可能参与过敏性哮喘的发病过程[13]。

 

在过敏性哮喘的发生发展过程中，Th2型细胞因子如IL-4、IL-5、IL-13对炎症细胞如巨噬细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞的浸润起到重要作用[14-16]。IL-13主要由Th2细胞、肥大细胞、单核巨噬细胞在活化状态下分泌。IL-13诱导B淋巴细胞合成大量的Ig E抗体同时增加嗜酸粒细胞的募集，引起气道上皮细胞表达诱导型一氧化氮合酶(i NOS)，诱导黏液产生和杯状细胞增殖，刺激气道平滑肌收缩，提高细胞外胶原蛋白和纤维母细胞向成肌纤维细胞表型转变等[17]。IL-13能够通过IL-13Rα1与IL-4R形成受体复合物，参与信号转导，激活靶基因转录，诱导Th0细胞分化、气道炎症、气道高反应、黏液产生。IL-13主要通过气道上皮细胞、平滑肌细胞来调节哮喘个体小气道嗜酸粒细胞的募集[18]。抑制Th2型细胞因子，特别是IL-13的促炎作用是哮喘免疫治疗的一个发展方向[19]。目前已经开发出抗IL-4抗体、抗IL-5抗体以及抗IL-13抗体等抑制相关炎症因子的单克隆抗体[20]。相关研究[21-22]发现，抗IL-5抗体及抗IL-13抗体组可明显抑制OVA诱导的哮喘小鼠肺部嗜酸粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润。但是单克隆抗体制作工艺相对较长，还存在安全、免疫原性等一系列问题[23-24]。因此，从哮喘发生机制靶基因方面，本研究试图探讨某种靶向治疗哮喘Th2因子相关的药物，从而阻断过敏性哮喘的发生和发展。本研究发现，miR-410在体外试验方面能够抑制IL-13 mRNA荧光素酶载体的荧光素活性，证实了miR-410能够靶向调控IL-13 mRNA。

 

本研究通过生物信息学软件targetscan预测发现了IL-13 3’UTR存在可能被miR-410结合的潜在靶点，通过构建psi CHECK-2双荧光素酶报告基因载体，从体外试验层面验证了miR-410对IL-13 mRNA的靶向结合作用，提示miR-410能够靶向调控IL-13 mRNA，从而影响其转录及表达。本研究确定了miR-410和IL-13 mRNA的靶向调控关系，为进一步在体内试验层面上研究其在哮喘发病中的作用奠定了基础。

 

参考文献

[1]LI X S, GONG X H, CHEN J, et al. miR-340 inhibits glioblastoma cell proliferation by suppressing CDK6,cyclin-D1and cyclin-D2[J]. Biochemical&biophysical research communications,2015,460(3):670-677.

 

[2]LIND E F,MILLAR D G,DISSANAYAKE D,et al. miR-155Upregulation in dendritic cells is sufficient to break tolerance in vivo by negatively regulating SHIP1[J]. The journal of immunology,2015,195(10):4632-4640.

 

[3]KIM R Y,HORVAT J C,PINKERTON J W,et al. MicroRNA-21drives severe,steroid-insensitive experimental asthma by amplifying phosphoinositide 3-kinase-mediated suppression of histone deacetylase 2[J]. Journal of allergy&clinical immunology,2017,139(2):519-532.

 

[4]李雪静，张园园，陈志敏．miRNA调控支气管哮喘研究进展[J]．临床儿科杂志，2019,37(6):466-469.

 

[5]何旗，王凌伟，邱晨．microRNA与支气管哮喘的研究进展[J]．广东医学，2016,37(14):2196-2199.

 

[6]朱剑洁，李昌崇．6岁以下儿童支气管哮喘诊治进展[J]．儿科药学杂志，2020,26(5):53-57.

 

[7]FANG C,LU W,LI C,et al. MiR-3162-3p is a novel MicroRNA that exacerbates asthma by regulating beta-tenin[J]. PLoS One,2016,11(3):e0149257.

 

[8]JOHANSSON K, CARINA M, RAMOS-RAMIREZ P, et al.MicroRNA-155 is a critical regulator of type 2 innate lymphoid cells and IL-33 signaling in experimental models of allergic airway inflammation[J]. Journal of allergy&clinical immunology,2016,139(3):1007.

 

[9]LIU Z,CHEN X,WU Q,et al. miR-125b inhibits goblet cell differentiation in allergic airway inflammation by targeting SPDEF[J]. European journal of pharmacology,2016(782):14-20.

 

[10]YANG H Y,BARBI J,WU C Y,et al. MicroRNA-17 modulates regulatory T cell function by targeting co-regulators of the foxp3transcription factor[J]. Immunity,2016,45(1):83-93.

 

[11]WILLIAMS A E,LARNER-SVENSSON H,PERRY M M,et al.MicroRNA expression profiling in mild asthmatic human airways and effect of corticosteroid therapy[J]. PLoS One,2009,4(6):e5889.

 

[12]KUMAR M,AHMAD T,SHARMA A,et al. Let-7 microRNAmediated regulation of IL-13 and allergic airway inflammation[J]. The journal of allergy and clinical immunology,2011,128(5):1077-1085.

 

[13]JIN R,HU S J,LIU X M,et al. Intranasal instillation of miR-410 targeting IL4/IL13 attenuates airway inflammation in OVAinduced asthmatic mice[J]. Molecular medicine reports,2019,19(2):895-900.

 

[14]FAN X H, CHENG L, YAN A H. Ameliorative effect of acetylshikonin on ovalbumin(OVA)-induced allergic rhinitis in mice through the inhibition of Th2 cytokine production and mast cell histamine release[J]. APMIS,2019,127(10):688-695.

 

[15]HABIBIAN R,DELIREZH N,FARSHID A A. The effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells on ovalbumininduced allergic asthma and cytokine responses in mice[J].Iranian journal of basic medical science,2018,21(5):483-488.

 

[16]王红利．白细胞介素-4和白细胞介素-13基因多态性对哮喘患儿Ig E表达的影响[J]．儿科药学杂志，2016,22(4):7-9.

 

[17]DUGGER K J,CHRISMAN T,SAYNER S L,et al. Beta-2adrenergic receptors increase TREG cell suppression in an OVAinduced allergic asthma mouse model when mice are moderate aerobically exercised[J]. BMC immunology,2018,19(1):9.

 

[18]DING F X,FU Z,LIU B. Lipopolysaccharide exposure alleviates asthma in mice by regulating Th1/Th2 and Treg/Th17 balance[J]. Med Sci Monit,2018(24):3220-3229. doi:10. 12659/MSM. 905202.

 

[19]WALSH G M. Biologics targeting IL-5,IL-4 or IL-13 for the treatment of asthma--an update[J]. Expert review of clinical immunology,2017,13(2):143-149.

 

[20]成家军，张方琪，张芳，等．联合应用IL-4突变体及抗IL-25抗体对哮喘小鼠炎性细胞及细胞因子水平的影响[J]．临床肺科杂志，2020,25(3):377-380.

 

[21]LI J H,SARUTA K,DUMOUCHEL J P,et al. Small molecule mimetics ofα-helical domain of IRAK2 attenuate the proinflammatory effects of IL-33 in asthma-like mouse models[J]. The journal of immunology,2018,200(12):4036-4043.

 

[22]CAZZOLA M,MATERA M G,LEVI-SCHAFFER F,et al.Safety of humanized monoclonal antibodies against IL-5 in asthma:focus on reslizumab[J]. Expert opinion on drug safety,2018,17(4):429-435.

 

[23]NTONTSI P,PAPATHANASSIOU E,LOUKIDES S,et al.Targeted anti-IL-13 therapies in asthma:current data and future perspectives[J]. Expert Opin Investig Drugs,2018,27(2):179-186.

 

[24]杨光勇，刘茜明，刘莉莉，等．抗IL-4R单链抗体与蜂毒肽融合蛋白的构建、表达与纯化[J]．华中科技大学学报(医学版)，2018,47(2):193-197.

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