紫草多糖的体外抗氧化活性研究

作者：刘婷，陈韩飞，赵文彬，李德芳，王振华，郑秋生，陈韩英

【摘要】 目的研究紫草多糖的体外抗氧化作用。方法通过·oh 、dpph·、超氧阴离子、脂质过氧化及红细胞溶血反应体系，检测紫草多糖的抗氧化能力。均采用比色法测定。结果紫草多糖对·oh、dpph·、超氧阴离子、脂质过氧化及红细胞溶血均有清除或抑制作用。结论紫草多糖在体外具有抗氧化作用。

【关键词】 紫草；多糖；抗氧化

新疆紫草arnebia euchroma(royle)johns为紫草科软紫草属植物，又名新疆软紫草，收载于《中国药典》，是我国常用的中药［1］，多为草本，以根入药，因其根皮暗紫色，故名“紫草”。该药具有凉血活血、解毒透疹之功效。已有研究表明紫草具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎及镇痛、抗肿瘤及免疫调节等生理活性［2］。现代医学证明，心脑血管疾病、衰老及肿瘤疾病的发生和发展与体内的活性氧自由基有密切关系，而许多抗氧化成分可以清除这些自由基，阻断由它们引发的体内脂质过氧化，能够预防上述疾病的发生发展近年来，人们发现天然药物是极有潜力的抗氧化剂资源，从中寻找新的抗氧化剂是现代医药和保健品行业的发展方向。多糖是继黄酮类、多酚类、皂苷类及鞣质类之后从天然植物中发现的又一类抗氧化活性成分［3］。许多植物多糖对各种活性氧(reactive oxygen species，ros)具有清除作用，能减少脂质过氧化产物丙二醛(mda)的生成量，提高抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶sod、谷胱甘肽过氧化物酶gshpx等)，表现出多种途经的抗氧化作用［4，5］。 研究多糖及其衍生物的抗氧化活性，对于开发出更多更好的天然抗氧化剂，逐步取代存在一定毒性、致畸性和潜在致癌性的化学合成抗氧化剂，具有重要的现实意义［6］。本实验研究紫草多糖的体外抗氧化活性。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药材与试剂紫草，购自新疆阿克苏地区，干燥粉碎过筛备用；1，1二苯基2苦肼基自由基（sigma公司）；tris(北京拜尔迪生物公司)；2硫代巴比妥酸（上海科丰化学试剂有限公司）；焦性没食子酸（天津市富宇精细化工有限公司）；其余试剂均为分析纯。

　　1.2 仪器多功能酶标仪（thermo 3001 varioskan flash）；ar2140型万分之一电子天平（梅特勒托利多仪器有限公司制造）；dl360超声波清洗机(浙江象山县石浦海天电子仪器厂)。

　　2 方法

　　2.1 紫草多糖的制备称取100 g紫草粗粉用600 ml的石油醚（30～60℃）脱脂3次，晾干，然后加入1 000 ml蒸馏水提取数小时，趁热过滤，重复3次。合并水提液并浓缩至原体积的1/4，加入3倍量无水乙醇，静置过夜后抽滤。将沉淀用无水乙醇、丙酮和乙醚依次洗涤，真空干燥，即得粗紫草多糖。

　　2.2 多糖对·oh的清除作用［7］

　　空白组：30 μl 0.75 mmol/l邻二氮菲溶液中加入60 μl 0.15 mol/l的pbs （ph=7.4），加入30 μl 的蒸馏水，充分混匀后，加入30 μl 0.75 mmol/l的硫酸亚铁，混匀后，再加入30 μl的1%的h2o2混匀。37 ℃的水浴中60 min后，在536 nm处，测定吸光度为a1；空白对照组：以30 μl 的蒸馏水代替h2o2重复上述操作，在536 nm处，测定吸光度为a2；样品组：以30 μl 的样品代替30 μl 的蒸馏水重复空白组操作，在536 nm处，测定吸光度为a3；样品对照组：60 μl 0.15 mol/l的pbs中加30 μl 的样品，充分混匀后，加入90 μl 的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为a4；空白参比组：60 μl 0.15 mol/l的pbs加入120 μl 的蒸馏水，在536 nm处测定吸光度为a5。清除率（%）=［（a3a4a1+a5）/（a2 a1）］×100%

　　2.3 多糖对dpph·的清除作用［8］

　　向100 μl dpph·乙醇溶液（浓度为0.2 mmol/l）中加入100 μl紫草多糖溶液。涡旋振荡器混匀，室温，避光放置30 min后，在517 nm处测定吸光度，平行测定3 次，并以相同浓度的维生素c作为阳性对照，计算清除率。

　　清除率（%）=［a0（a1a2）］/a0×100%式中：a0为dpph·溶液100 μl +无水乙醇100 μl的吸光度；a1为dpph·溶液100 μl +样品溶液100 μl的吸光度；a2为样品溶液100 μl +无水乙醇100 μl的吸光度。

　　2.4 多糖对超氧阴离子的清除作用［9］

　　取浓度为0.05 mol/l的trishcl（ph=8.2）缓冲液100 μl，25 ℃预热20 min，加入50 μl不同浓度的紫草多糖溶液，立即加入40 μl的3 mmol/l的邻苯三酚，振荡使之充分反应，4 min后，用10 μl的3 mol/l的hcl终止反应，在325 nm处测定吸光度（a1），平行测定3次，并以相同浓度的维生素c作为阳性对照。模型对照组（a0）用50 μl的蒸馏水代替样品液。空白对照组（a2）用40 μl的蒸馏水代替邻苯三酚。

　　抑制率（%）=［（a0a1+ a2）/a0］×100%

　　2.5 多糖对卵黄脂质过氧化的抑制作用［10］

　　卵黄悬液的配制：新鲜鸡蛋去卵清，卵黄用等体积的ph=7.4的0.1 mol/l pbs配成1∶1悬液，并用磁力搅拌器搅拌10 min（置于冰箱中4℃）备用，使用前用pbs稀释成1∶25的悬液。吸取1∶25的卵黄悬液20 ml，加入20 ml的不用浓度的紫草多糖溶液，再加入20 ml的25 mmol/l的feso4，用ph=7.4，0.1 mmol/l的pbs补至200 ml，37℃振荡15 min，取出后再加入50 μl的20%的三氯乙酸，4 000 r/min离心8 min，吸取100 ml上清液加入50 ml 0.8%tba，封口，沸水浴中煮15 min，在532 nm处测吸光度，平行测定3次，并以相同浓度的维生素c作为阳性对照。以不加样品管的吸光度为a0，以样品加pbs管的吸光度为a样。

　　抑制率（%）=［（a0a+a样）/a0］×100%

　　2.6 多糖对红细胞溶血的抑制作用［11］

　　小鼠摘眼球取血，加入肝素制成抗凝血，以4 000 r/min离心5 min，再用预冷的生理盐水洗3次，制成0.5%的红细胞悬浮液。取红细胞悬浮液200 ml，加入样品溶液40 ml，最后加入0.1 mol/l的h2o2 20 ml，混匀，于37℃水浴中温浴60 min，然后3 000 r/min离心10 min，取上清液，用生理盐水稀释5倍，于415 nm处测定吸光度（以红细胞在超纯水中的溶血率为100%计算）。

　　抑制率（%）=（a0a样）/（a0-a）×100%

　　式中：a0，h2o2诱导对照组吸光度；a样，样品组吸光度；a，正常组吸光度。

　　2.7 统计分析

　　每次试验均设4个平行管，取平均值为1次试验数据，试验重复3次，采用spss 10.0软件处理，所有数据均用±s表示。

　　3 结果

　　3.1 紫草多糖清除羟自由基的能力结果见图1。

fenton反应是最常见的产生羟自由基的化学反应，h2o2的量和fenton反应产生的·oh的量成正比，当给予电子受体后，用gress试剂显色，形成红色物质，其呈色与·oh的量成正比关系。由图1可见，紫草多糖在实验浓度范围内对羟自由基的清除作用呈现出良好的量效关系，并且浓度越大，紫草多糖的清除羟自由基的能力越接近维生素c。

　　3.2 紫草多糖清除dpph·的能力结果见图2。

　　人工合成的dpph是少数化学性质稳定的自由基之一，其乙醇溶液呈深紫色，在517 nm附近有强吸收峰。当dpph·溶液中加入自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数成定量关系，因而可用比色法进行定量分析，评价样品的抗氧化能力［12］。从图2可以看出，紫草多糖具有较强的清除dpph自由基的能力，且随着样品溶液浓度的增加，清除率逐渐增高，呈剂量依赖关系。

　　3.3 紫草多糖清除超氧阴离子的能力结果见图3。

在碱性条件下，邻苯三酚发生自氧化反应，生成o2·和有色中间产物，该有色物质在325 nm处有一特征吸收峰。当加入清除剂时， o2·的生成受到抑制，邻苯三酚的自氧化反应受阻，溶液在325 nm处的吸光度减小。故通过测定a325值可以定量计算出清除剂的清除率［13］。实验结果（图3）表明，紫草多糖、维生素c对超氧阴离子的生成均有清除作用，且随着浓度的增加作用增强。在较低浓度时，紫草多糖对超氧阴离子的清除作用强于维生素c。

　　3.4 紫草多糖对卵黄脂质过氧化的抑制作用结果见图4。

卵黄中磷脂c2位上所含极低密度脂蛋白（vldl）和低密度脂蛋白（ldl）中的不饱和脂肪酸（pufa）在亚铁离子的催化下，能诱发过氧化，产生烷氧基（ro·）和烷过氧基（roo·），从而引发链式反应。且在加热的条件下，其产生的过氧化物可与硫代巴比妥酸（tba）反应产生红色化合物，并在532 nm处有最大吸收［14］。由图4可知，紫草多糖、维生素c对卵黄脂质过氧化的抑制作用呈剂量依赖性，且在相同浓度下，紫草多糖对脂质过氧化的抑制作用接近维生素c。

　　3.5 紫草多糖对红细胞溶血的抑制作用结果见图5。

　　过氧化氢在体外诱导红细胞氧化而发生溶血，致使红细胞膜流动性降低，膜脆性增加，改变细胞膜的完整性，导致红细胞损伤，胞内物质外流。结果表明，紫草多糖、维生素c均能降低h2o2诱导的红细胞氧化溶血率，溶血抑制率随着样品浓度的增大而增加，当浓度低于12.5 mg/l时，紫草多糖与维生素c抑制溶血的能力相当。

　　4 讨论

o2·、·oh 及h2o2是生物体内主要的活性氧自由基，由它们引发的体内脂质过氧化是机体衰老、动脉硬化、心血管病及肿瘤发生的重要原因，而使用生物抗氧化剂切断过氧化链式反应, 可以抑制机体的自由基损伤，从而保持最佳健康状态和防治相关疾病， 延缓衰老［15］。目前国内外也已将抗氧化检测用于抗衰老等保健食品的评价，对保健食品的开发也具有积极作用［16］。

　　我们的研究表明，紫草多糖具有较强的清除羟自由基、dpph·及超氧阴离子和抑制卵黄脂质过氧化的作用，且呈剂量依赖性，其可能的作用机理如下：①紫草多糖可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，减少脂质过氧化反应链的长度，阻断或减缓脂质过氧化的进行；②对于·oh而言，可快速地攫取多糖碳氢链上的氢原子结合成水，而紫草多糖的碳原子上则留下一个成单电子，成为碳自由基，进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物；③对于o2·，紫草多糖可与其发生氧化反应，最终达到清除的目的［17］。

　　目前，对紫草多糖抗氧化的研究不够深入，抗氧化作用与多糖结构的关系仍不明确。此外，紫草多糖用于药理学实验的是一些粗制品，这使得要在分子水平上阐明其药理作用和作用机制受到了很大限制，有待于我们的进一步深入开展多糖的纯化以及抗氧化作用与其构效关系的研究。

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