致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究

作者：黄宏思，黄卫彤，秦静英，黄衍强

【摘要】 目的探讨负载肿瘤抗原dc诱导的ctls对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法以负载肿瘤细胞抗原的dcs体外诱导ctls，用elisa法检测ifn-γ和il-12的表达水平，用ldh法检测ctl对乳腺癌细胞的杀伤作用。结果负载肿瘤抗原dc组ifn-γ和il-12的浓度高于未致敏dc组、抗原组及单核细胞对照组(p＜0.05)，且负载抗原dc组所刺激的ctls的杀伤作用也强于未致敏dc组、抗原组及单个核细胞组(p＜0.01)及对照的ht-29组(p＜0.01)。结论采用乳腺癌细胞冻融抗原体外致敏dc，诱导产生肿瘤抗原特异性ctls具有显著的抑瘤效应，实验证明致敏dc治疗乳腺癌是一种有效的方法，有望成为乳腺癌免疫治疗的新疗法。

【关键词】 乳腺癌； 树突状细胞； 细胞毒性t细胞

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女新发乳腺癌，占女性所有肿瘤的18%。乳腺癌总的5年生存率约50%～60%，近50%患者治疗后出现复发转移。晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18～30个月。人们一直在努力发展新的治疗策略以降低乳腺癌的复发和转移，提高患者生活质量并尽可能延长乳腺癌患者的生存期［1］。生物治疗是近年来发展迅猛的又一重要治疗手段。目前的研究表明，树突状细胞（dc）激活的细胞毒性t淋巴细胞（ctls）介导的免疫反应在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用［2，3］。本研究应用冻融法获取乳腺癌细胞抗原致敏dc，观察其诱导的ctls对乳腺癌细胞的杀伤作用，探讨dc疫苗用于乳腺癌患者免疫治疗的可行性。

　　1 材料

　　人乳腺癌细胞株mcf-7、人结肠癌细胞株ht-29购自中国医学科学院肿瘤医院。rh gm-csf、rhil-4、rh tnf-a为美国biosouce公司产品。人il-12、ifn-γ elisa试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。ficoll-hypaque淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司。乳酸脱氢酶测试盒为美国sigma公司产品。

　　2 方法

　　2.1 mcf-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养mcf-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，5 000 r/min离心20 min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原， 4℃保存备用。

　　2.2 树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞（pbmc），培养获得贴壁的dc前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养，分为a、b、c 3组，其中a、b组均加入rhgm-csf 800 u/ml，rhil-4的 1 000 u/ml和tnf-α 10 ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50 μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。

　　2.3 细胞毒性t淋巴细胞（ctl）的体外诱导ficoll-hypaque密度梯度离心获得健康者外周血pbmc，用自制的尼龙毛柱进行分离获取t淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1 ml。分为a、b、c、d 4组:前3组分别加入上述收集的a、b、c组细胞（效应细胞与刺激细胞比为40：1），第4组（d组）加入冻融抗原50 μl，每组8个复孔。共同孵育4 d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行ifn-γ，il-12的检测。

　　2.4 ctl s对乳腺癌细胞的杀伤作用将mcf-7，ht-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上a、b、c、d组ctl（效靶比40∶1），每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。24 h后离心，取上清液100 μl于4 ml eppen-dorf管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。

　　2.5 ifn-γ，il-12的检测取上述体外诱导至第6天的ctls细胞上清液每孔100 μl，按晶美公司elisa检测试剂盒所示方法测定ifn-γ和il-12含量。

　　2.6 统计学方法实验数据用 ±s表示，应用spss12.0统计软件统计分析。组间比较采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。

　　3 结果

　　3.1 细胞因子ifn-γ和il-12的检测乳腺癌细胞裂解物致敏后的dc与淋巴细胞一起培养，细胞因子ifn-γ和il-12的含量比未致敏dc组、单纯乳腺癌细胞裂解物组和单个核细胞对照组高（p＜0.05）。表1 细胞因子ifn-γ和il-12的检测结果（略）

　　3.2 ctls杀伤活性的检测肿瘤抗原致敏dc组诱导的ctls对靶细胞的杀伤活性优于未致敏dc组及单核细胞组、单纯抗原组（p＜0.01）。且其对乳腺癌肿瘤细胞（mcf-7）的杀伤活性也明显优于对非乳腺癌肿瘤细胞（ht-29）的杀伤活性(p＜0.01)，见表2。说明肿瘤致敏dc诱导的ctls杀伤活性具有特异性。表2 不同组ctls对不同靶细胞的细胞毒活性（略）

　　4 讨论

　　树突状细胞作为机体内免疫反应的始动子和调节子，在机体抗肿瘤免疫反应中极其重要，是近年来免疫学研究中最活跃的领域。

　　在肿瘤发生发展过程中，肿瘤抗原不能有效呈递给t细胞是导致免疫逃逸的重要原因。同时在荷瘤机体中，由于存在抗原递呈细胞的功能低下甚至缺陷，特别是dc在数量和功能的改变，可造成肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，导致肿瘤的形成和发展［4］。利用成熟dc负载肿瘤抗原制备出高效dc疫苗，是目前研究的热点，也是能否诱导肿瘤特异性ctl产生的关健所在［5，6］。目前已研究出多种dc负载抗原的方法［7］，其中冻融裂解法获得肿瘤全抗原，无需明确肿瘤抗原具体的抗原成分，而有多种不同肿瘤抗原成分同时刺激dc，诱导出针对不同抗原决定簇的特异性ctl，该法具有潜在的优势。

　　从我们的检测结果可以看出负载肿瘤裂解物的dcs分泌il-12的能力增高了，并且其与ctl分泌ifn-γ的增加呈正相关。这主要是由于il-12可以影响t细胞的极化方向，由于t细胞上调ifn-γ表达，通过分泌ifn-γ等提高杀伤活性。这些结果表明用il-12、ifn-γ的分泌来反应肿瘤抗原致敏dc对ctls的体外诱导可能是一个有用的方法。

　　本研究中，抗原负载dcs诱导的ctls对乳腺癌细胞在体外有很好的杀伤活性，与未致敏dc组ctls及未成熟dc诱导的ctls组（pbmc组） 有明显差异，说明成熟dc能够呈递肿瘤细胞抗原，激发ctls的细胞毒作用。而非乳腺癌细胞细胞（ht-29）的杀伤活性较差（p＜0.01），说明这种用负载乳腺癌细胞抗原的dc诱导的ctls细胞毒作用有其特异性。这种良好的特异性杀伤活性表明肿瘤裂解物致敏的dc疫苗刺激的ctls的免疫治疗可作为乳腺癌患者新治疗手段，但过渡到临床应用仍需体内实验加以证实。

【参考文献】
　［1］戚晓军，赵卫红，王怀瑾.乳腺癌的分子靶向治疗研究进展［j］.中国处方药，2008，73(4):82.

　　［2］yanoy，ueday，itoht，et al .a new strategy using autologous dendritic cells and lymphokine-activated killer cells for cancer immunotherapy:efficient maturation of dcs by co-culture with lak cells in vitro［j］.oncol rep，2006，16（1）:147.

　　［3］曹雪涛.树突状细胞的基础与临床研究新进展［j］.中国免疫学杂志，1998，14（3）:167.

　　［4］schakel k， mayer e， federle c， et al. a novel dendritic cell population in human blood: one-step immunomagnetic isolation by a specific mab(m-dc8) and in vitro priming of cytotoxic t lymphocytes［j］. eur j immunol，1998，28(12):4084.

　　［5］imura k， ueda y， hayashi t， induction of cytotoxic t lym-phocytes against human cancer cell lines using dendritic cell-tumor cell hybrids generated by a newly developed electrofusion technique［j］. int oncol，2006，29(3):531.

　　［6］张希国，师建国，刘彦仿，等.比较两类树突状细胞激活的肿瘤特异性ctl对肝癌荷瘤裸鼠的治疗作用［j］.肿瘤防治研究，2006，33(7):22.

　　［7］galea lj， wells jw， darling d， et al. strategies for antigen choice and priming of dendritic cells influence the polariza tion and efficacy of antitumor t cell responses in dendritic cell based cancer vaccination［j］.cancer immunol immunother， 2004，53∶9639.

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