v2，4二硝基氟苯柱前衍生化HPLC法测定阿仑膦酸

作者：林慧菁，杨乐，蔡烁佳，蓝明雄

【摘要】 目的 建立2，4二硝基氟苯柱前衍生化hplc法测定阿仑膦酸钠片的含量。方法 碱性条件下供试品与2，4二硝基氟苯进行衍生化反应，采用ultimate xbc18柱，流动相为乙腈0.01 mol·l-1kh2po4溶液(用三乙胺调节ph值至7.0)，梯度洗脱,流速为1.0 ml·min-1，检测波长为365 nm。结果 阿仑膦酸钠质量浓度在0.05～1.00 mg·ml-1范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 6)，平均回收率为99.8%(n=9)。结论 该方法专属性好，准确、灵敏，适合用于阿仑膦酸钠片的含量测定。

【关键词】 阿仑膦酸钠片;柱前衍生化;高效液相色谱法;含量

　　(dongguan institute for drug control，dongguan ,guangdong 523109,china)abstract:objective to develop a hplc method with precolumn derivatization for the determination of alendronate sodium alendronate sodium was derivatized with 2,4dinitrofluorobenin,and the analytical column was ultimate xb mobile phase was consisted of acetonitrile and 0.01 mol·l-1 potassium dihydrogen phosphate solution (ph adjusted to 7.0 with triethylamine). the flow rate was 1.0 ml·min-1. the detection wavelength was 365 s the linear range was 0.05-1.00 mg· ml-1(r=0.999 6)with the average recovery of 99.8%(n=9).conclusion the method is simple,accurate,sensitive and suitable for the determination of alendronate sodium tablets.

　　key words:alendronate sodium tablets;precolumn derivatization;hplc;content

　　阿仑膦酸钠(alendronate sodium)是一种骨代谢调节剂，为氨基二膦酸盐，化学名为4氨基1羟基亚丁基，1995年被美国fda推荐为骨质疏松症的 治疗 用药[1]，在国际上被认为是21世纪最具潜力的骨质疏松症药物。国家标准中阿仑膦酸钠片的含量测定法采用测量误差较大的钼蓝比色法[2]，不利于控制药品的质量，因此建立一种简便的含量测定方法非常必要。 文献 报道阿仑膦酸钠片的含量测定方法有elsdhplc法[3]、fmoc柱前衍生hplc法[4-5]。本实验以2，4二硝基氟苯为衍生化试剂[6]，采用化学衍生技术接入强紫外吸收基团，使转化成强紫外吸收衍生物后测定其含量的方法进行测定。选用的c18色谱柱使用广泛，同时避免了fmoc衍生物出现水解的情况，且方法灵敏、操作方便，具有很大的实用价值。

　 　1 仪器与试药

　　高效液相色谱仪(waters 515泵，waters 2996 pda检测器，waters empower软件);bp211d 电子 分析天平(德国sartorius公司);wb14恒温水浴箱(德国memmert公司)。

　　阿仑膦酸钠工作对照品(成都天台山制药有限公司，含量为100.0%)、阿仑膦酸钠片(成都天台山制药有限公司，批号100101，标示量0.01 g;杭州默沙东制药有限公司，批号09440，标示量0.07 g;北京万生药业有限责任公司，批号20090602，标示量0.07 g);2，4二硝基氟苯(东京化成 工业 株式会社，批号900280000);乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

　 　2 方法与结果

　　2.1 色谱条件

　　色谱柱为ultimate xbc18柱;以乙腈为流动相a，0.01 mol·l-1 kh2po4溶液(用三乙胺调节ph值至7.0)为流动相b，以1.0 ml·min-1的流速进行梯度洗脱(0～0.1 min，a为10%～25%;0.1～6.0 min，a为25%;6.0～6.1 min;a为25%～10%;6.1～9 min，a为10%)，检测波长为365 nm，进样量为10 μl。

　　2.2 衍生化条件的选择

　　2.2.1 衍生反应的ph值 2，4二硝基氟苯在碱性条件下能与含伯或仲胺基的化合物衍生。为确定本反应ph值的条件，除了0.05 mol·l-1nahco3溶液(ph8.4)、0.05 mol·l-1 na2co3溶液(ph11.1)外，还在其基础上用naoh试液配制了ph值为9.0、10.0、11.5、12.0的一系列溶液，依法进行衍生化反应。精密吸取反应后的溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。测定结果发现无明显差异，因在ph11附近峰面积达到最大，故选用0.05 mol·l-1 na2co3溶液。见图1。

　　2.2.2 衍生化试剂与样品的质量比 称取2，4二硝基氟苯约1.5 g，置50 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为30 mg·ml-1的衍生化溶液，并逐步稀释成0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、7.5、15、22.5、30 mg·ml-1的一系列溶液。各取2 ml，分别与对照品溶液(阿仑膦酸钠质量浓度为0.25 mg·ml-1)9份，每份各3 ml，依法进行衍生化反应，衍生化试剂与样品的质量比分别为1、2、4、8、16、20、40、60、80。

　　精密吸取反应后的溶液各10 μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，衍生化试剂与样品质量比为16以上时，测得的衍生物峰面积无明显变化，因此选用15 mg·ml-1的衍生化溶液进行反应。见图2。

　　2.2.3 反应时间 取对照品溶液(阿仑膦酸钠质量浓度为0.25 mg·ml-1)9份，各3 ml，分置10 ml量瓶中，加衍生化溶液2 ml，置40 ℃水浴中分别反应2、5、10、20、30、40、60、120 min。取出，放冷，用0.05 mol·l-1na2co3溶液稀释至刻度，摇匀。精密吸取反应后的上述溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，反应时间在20 min后衍生峰面积无明显变化，因此选用20 min作为反应时间。见图3。

　　2.3 方法学考察

　　2.3.1 衍生化溶液的配制 称取2，4二硝基氟苯约1.5 g，置100 ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，即得。

　　2.3.2 供试品溶液的配制 取本品20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于阿仑膦酸钠12.5 mg)，置50 ml量瓶中，加0.05 mol·l-1 na2co3溶液适量，振摇，使阿仑膦酸钠溶解，稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

　　2.3.3 对照品溶液的配制 取阿仑膦酸钠工作对照品约12.5 mg，精密称定，按照“2.3.2”项下的方法，自“置50 ml量瓶中”起，依法制成每1 ml中含阿仑膦酸钠0.25 mg的对照品溶液。

　　2.3.4 阴性对照溶液的制备 取空白辅料适量，按照“2.3.2”项下的方法，自“置50 ml量瓶中”起，依法制成阴性对照溶液。

　　2.3.5 空白溶液 取0.05 mol·l-1 na2co3溶液，作为空白溶液。

　　2.3.6 衍生化反应 取对照品、供试品、阴性对照和空白溶液各3 ml，置10 ml量瓶中，加衍生化溶液2 ml，置40 ℃水浴中反应20 min，取出，放冷，用0.05 mol·l-1 na2co3溶液稀释至刻度，摇匀，作为反应后的对照品、供试品、阴性对照和空白溶液。

　　2.4 专属性试验

　　分别精密吸取反应后的对照品、供试品、阴性对照和空白溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。在该色谱条件下，阿仑膦酸钠的保留时间约为5.1 min，理论板数应不低于3 000。空白辅料及空白溶液无干扰，反应后的衍生物主峰与相邻峰的分离度符合要求。见图4。

　　2.5 线性关系考察

　　精密称取阿仑膦酸钠对照品适量，加0.05 mol·l-1 na2co3溶液分别配制成0.05、0.125、0.25、0.50、0.75、1.00 mg·ml-1的系列对照品溶液，按“2.3.6”项下操作。取衍生后溶液，各进样10 μl，以质量浓度(ρ)为横坐标，峰面积(a)为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程为：

　　a= 8.7596×106ρ+8.3838×102，r=0.999 6(n=6)，结果表明质量浓度在0.05～1.00 mg·ml-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

　　2.6 精密度试验

　　取“2.5”项下系列3的对照品(0.25 mg·ml-1)衍生化产物溶液，连续进样6次，记录色谱图，测得阿仑膦酸钠衍生物峰面积rsd为0.66%(n=6)，表明仪器的精密度良好。

　　2.7 重复性试验

　　取阿仑膦酸钠片(批号100101)的细粉适量(约相当于阿仑膦酸钠12.5 mg)，精密称定，按“2.3.6”项下方法制备供试品衍生化溶液6份，注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。测得阿仑膦酸钠含量为107.1%，rsd为1.3%。结果表明，本方法重复性良好。

　　2.8 稳定性试验

　　取阿仑膦酸钠片(批号100101)的细粉适量(约相当于阿仑膦酸钠12.5 mg)，精密称定，按“2.3.6”项下方法制备供试品衍生化溶液，分别在0、2、4、6、8、12 h进样10 μl，记录色谱图，测得阿仑膦酸钠钠衍生物峰面积rsd为1.4%(n=6)。结果表明，溶液在12 h内稳定性良好。

　　2.9 回收率试验

　　精密称定阿仑膦酸钠工作对照品60.98 mg，置50 ml量瓶中，加0.05 mol·l-1 na2co3溶液适量，振摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液(阿仑膦酸钠质量浓度为1.219 6 mg·ml-1)。另取同一批已知含量(107.1%)的供试品溶液9份，精密称定，分别精密加入对照品贮备液3、5、7 ml各3份，按“2.3.6”项下方法制备溶液，依法测定。结果平均回收率(n=9)为99.8%，rsd为1.8%。见表1。

　　2.10 样品测定

　　取3批阿仑膦酸钠片(批号100101、09440、0090602)，分别按“2.3.6”项下方法配制备溶液，依法测定含量，结果3批阿仑膦酸钠片的质量分数分别为106.2%、101.4%、108.7%。表1 回收率试验结果

　 　3 讨论

　　本试验先后对kcromil 1005c18、迪马diamonsil c18柱，以及不同的高效液相色谱仪(waters 515、岛津lc20at)进行考察。结果表明上述色谱柱与仪器同样满足系统适用性要求。

　　曾尝试用不同比例的甲醇0.01 mol·l-1kh2po4溶液作为流动相，但使用该流动相时间稍长，易引起管路盐分的积蓄，柱压上升较快，须用乙腈冲洗在线过滤器的筛板。而选用了乙腈0.01 mol·l-1 kh2po4溶液组合后，柱压上升的情况未见出现;调节ph值用三乙胺与naoh均可，二者无明显区别;在洗脱形式方面，选用梯度洗脱，可使阿仑膦酸钠衍生主峰峰形更尖锐，理论板数达到10 000以上，同时可缩短主峰后杂峰的保留时间，节省实验时间。

【 参考 文献 】
　[1] 胡惠静,卢婷利,陈涛.阿仑膦酸钠药物的分析[j].